miR-101-3p靶向調控Rac1對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響

劉娜，翁閃凡，陳姝，葉國麟

(1 佛山科學技術學院，廣東佛山528000；2 佛山市第一人民醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性癌癥死亡原因的的首位[1]。侵襲和轉移是導致乳腺癌預后不良的主要原因。但目前乳腺癌侵襲和轉移的分子機制尚不完全清楚[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，長度為19～25個核苷酸，主要通過結合靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，參與基因轉錄后調控[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過調控癌基因或抑癌基因表達，參與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程[4～6]。miR-101-3p是miR-101家族的成員之一，已有研究證實，miR-101-3p表達在肺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤組織中明顯下調，并與腫瘤的侵襲和轉移有關[7～11]。Rac1是Rho家族的重要成員之一，可參與細胞有絲分裂、骨架重排等生物學過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中Rac1高表達，且其高表達可促進腫瘤的侵襲和轉移[12，13]。TargetScan軟件預測，Rac1是miR-101-3p的靶向調控基因。因此，我們推測miR-101-3p可能通過靶向調控Rac1促進乳腺癌的侵襲和轉移。為此，2016年7月～2018年7月，我們進行了如下研究。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及正常乳腺細胞株HBL-100，購自上海生命科學院細胞和生物化學研究所。miR-101 mimics、miR-101抑制物及其陰性對照物，美國Ambion公司。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。Mastercycler Ep Realplex實時熒光定量PCR儀，德國Eppendorf公司；Multiskan MK3型酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。野生型與突變型Rac1熒光素酶報告基因載體，美國Introvigen公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒，日本TaKaRa株式會社；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京艾然生物科技有限公司。Rac1、MMP-2、GAPDH一抗及HRP標記的羊抗鼠二抗，美國CST公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) 將MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及HBL-100細胞37 ℃快速解凍，然后將MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細胞接種于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，HBL-100細胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合80%以上時，按1∶3傳代。取傳2代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 乳腺癌細胞篩選 收集傳2代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及HBL-100細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經超微量分光光度計鑒定，A260/A280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：miR-101-3p上游引物5′-ACGGGCGAGCTCAGTACTGTG-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGCTA-3′；GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。選擇miR-101-3p相對表達量最低的乳腺癌細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞分組與轉染 取miR-101-3p相對表達量最低的乳腺癌細胞，接種于6孔板，每孔1×105個。隨機分為對照組、miR-101-3p抑制物組和miR-101-3p mimics組，每組設3個復孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁且生長融合30%左右時，miR-101-3p抑制物組加入miR-101-3p抑制物和Lipofectamine2000轉染試劑，miR-101-3p mimics組加入miR-101-3p mimics和Lipofectamine2000轉染試劑，對照組僅加入等量Lipofectamine2000轉染試劑。收集各組轉染24 h細胞，按1.3中的方法檢測miR-101-3p相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞侵襲和遷移能力檢測 ①細胞侵襲能力：采用Transwell侵襲實驗。收集各組轉染24 h細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，細胞密度為1×106個/mL。將Transwell小室的上下室之間用包被了人工基底膠的聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分隔，上室加入細胞懸液100 μL，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育8 h。取出聚碳酸酯微孔膜，用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細胞，然后中性甲醛固定，蘇木素染色。顯微鏡下隨機選取5個50倍視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以穿膜細胞數(shù)代表細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。②細胞遷移能力：采用Transwell遷移實驗。方法同上，但聚碳酸酯微孔膜不包被人工基底膠。實驗重復3次，取平均值。

1.6 miR-101-3p靶向調控基因檢測 采用雙熒光素酶報告基因實驗。取miR-101-3p相對表達量最低的乳腺癌細胞，接種于24孔板，每孔2×104個。隨機將細胞分為野生型Rac1+miR-101-3p mimics組、突變型Rac1+miR-101-3p mimics組、野生型Rac1+陰性對照物組、突變型Rac1+陰性對照物組，每組設3個復孔，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合80%左右時，按Lipofectamine2000試劑盒說明分別加入相應的轉染物和轉染試劑。各組轉染24 h，每孔加入1×passive Lysis Buffer 100 μL，充分混勻，室溫孵育15 min。每孔取20 μL，置于96孔發(fā)光檢測板，于ModulusTM發(fā)光檢測儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435、HBL-100細胞miR-101-3p表達比較 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435、HBL-100細胞miR-101-3p相對表達量分別為2.33±0.42、2.05±0.26、1.82±0.38、3.05±0.42。MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細胞miR-101-3p相對表達量均明顯低于HBL-100細胞(P均<0.05)。以MDA-MB-435細胞miR-101-3p相對表達量最低。

2.2 各組miR-101-3p表達比較 對照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組miR-101-3p相對表達量分別為1.47±0.39、0.58±0.16、9.22±0.82。miR-101-3p抑制物組miR-101-3p相對表達量明顯低于對照組，而miR-101-3p mimics組miR-101-3p相對表達量明顯高于對照組(P均<0.05)。

2.3 各組細胞侵襲能力比較 對照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組穿膜細胞數(shù)分別為(105.67±7.77)、(188.00±18.08)、(68.67±9.45)個。miR-101-3p抑制物組穿膜細胞數(shù)明顯高于對照組，而miR-101-3p mimics組穿膜細胞數(shù)明顯低于對照組(P均<0.05)。

2.4 各組細胞遷移能力比較 對照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組穿膜細胞數(shù)分別為(85.67±11.50)、(194.20±15.38)、(54.67±8.33)個。miR-101-3p抑制物組穿膜細胞數(shù)明顯高于對照組，而miR-101-3p mimics組穿膜細胞數(shù)明顯低于對照組(P均<0.05)。

2.5 miR-101-3p靶向調控基因驗證 野生型Rac1+miR-101-3p mimics組熒光素酶活性為0.21±0.04，野生型Rac1+陰性對照物組為0.64±0.09，突變型Rac1+miR-101-3p mimics組為0.65±0.05，突變型Rac1+陰性對照物組為0.59±0.09。野生型Rac1+miR-101-3p mimics組熒光素酶活性明顯低于其他三組(P均<0.05)，而其他三組兩兩比較P均>0.05。

3 討論

近年來，隨著醫(yī)學技術的發(fā)展、手術方式的不斷改進以及靶向藥物的臨床應用，乳腺癌早期預后明顯提高[14]。但對晚期多發(fā)轉移性乳腺癌仍缺乏有效的治療手段，患者預后仍然較差[15]。侵襲和轉移是導致乳腺癌預后不良的主要原因。但目前乳腺癌侵襲和轉移的分子機制尚不完全清楚[2]。miRNA是一類高度保守的小分子非編碼單鏈RNA。近年研究已證實，miRNA在多種腫瘤組織中差異表達，可調控腫瘤細胞增殖、凋亡以及血管形成，從而促進腫瘤的侵襲和轉移，有可能作為腫瘤的治療靶點。因此，深入了解miRNA的功能對于分子靶向藥物的研發(fā)具有重要意義[16，17]。miR-101-3p屬于腫瘤抑制因子，在鼻咽癌、肝癌等組織中表達明顯降低，并與腫瘤的侵襲和轉移有關[18，19]。在乳腺癌組織中miR-101-3p表達亦明顯降低[20]。但其在乳腺癌侵襲和轉移中的作用機制尚不清楚。

本研究首先采用qRT-PCR法檢測了乳腺癌MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細胞及正常乳腺HBL-100細胞中miR-101-3p表達，結果發(fā)現(xiàn)，三種乳腺癌細胞miR-101-3p表達均明顯降低，且以MDA-MB-435細胞表達最低，與Liu等[20]報道一致。為進一步驗證miR-101-3p對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響，我們采用瞬時轉染技術將miR-101-3p抑制物、miR-101-3p mimics轉染入MDA-MB-435細胞，通過Transwell侵襲和遷移實驗觀察了細胞侵襲和遷移能力，結果發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p抑制物組細胞侵襲和遷移能力均明顯高于對照組，而miR-101-3p mimics組細胞侵襲和遷移能力均明顯低于對照組，表明miR-101-3p與乳腺癌細胞的侵襲和遷移有關。

眾所周知，miRNA主要是通過結合靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，參與其靶基因的轉錄后調控[3]，主要體現(xiàn)在一方面可與沉默核糖蛋白復合物結合，通過序列完全互補的方式降解目的蛋白，另一方面可通過非完全互補結合發(fā)揮轉錄后調控。TargetScan軟件能夠預測miRNA的靶基因及其結合位點。我們采用TargetScan軟件預測發(fā)現(xiàn)，Rac1可能是miR-101-3p的靶基因。Rac1是一種Rho GTP酶，具有GTP和GDP兩種狀態(tài)，可結合并水解鳥苷酸，廣泛表達于人體各種組織。Rac1異常表達可引起糖尿病、亨廷頓舞蹈病等[21，22]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中Rac1高表達，且其高表達可促進腫瘤的侵襲和轉移[12，13]。有文獻報道，在乳腺癌組織中Rac1表達亦明顯升高，并通過調控Rac1/ROS/MMPs信號通路，促進腫瘤的侵襲和轉移[23]。為了探究miR-101-3p與Rac1的靶向調控關系，本研究雙熒光素酶報告基因實驗顯示，Rac1為miR-101-3p的直接靶基因。

綜上所述，miR-101-3p可能通過靶向調控Rac1參與乳腺癌的侵襲和轉移。這為轉移性乳腺癌的靶向治療提供了新思路。