黑水虻對有害物質的降解作用研究進展

■梅瀚杰 胡文鋒

(華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

黑水虻（Hermetia illucens L.）是一種雙翅目水虻科的昆蟲，在熱帶和亞熱帶一些全年溫暖的地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[1]，其擁有豐富蛋白質和適當?shù)闹竞臀⒘吭?，是?lián)合國糧農(nóng)組織推薦的飼用昆蟲，被認為是優(yōu)良的人畜蛋白來源[2]，其中預蛹期干物質含32%蛋白質、37%脂肪、19%礦物質、9%的幾丁質[3]，成蟲期粗蛋白可高達57.6%，還有21.6%的脂肪[4]。鑒于昆蟲相較于豬和牛有更高的飼料轉化能力[5]，甚至在一些案例中高于某些家禽[6]，同時他們相比于傳統(tǒng)牲畜排放的溫室氣體和氨氣更少[6-7]。除此以外，作為腐生性昆蟲，黑水虻被大量用于有機廢棄物的處理，近年來利用黑水虻對餐廚垃圾和人畜糞便等垃圾進行高效轉化資源的報道也越來越多[8-18]。在一些中低收入國家，對垃圾的錯誤處理嚴重影響了生活環(huán)境和民眾健康[19]，而落后的垃圾管理浪費了很多有價值的能量和營養(yǎng)成分[20-21]。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，抗生素、重金屬殘留問題日益突出，造成了嚴重的環(huán)境污染[22-26]，同時有機廢棄物中致病菌的處理也是一個棘手問題。雖然目前已經(jīng)有大量針對環(huán)境中重金屬和抗生素等有害物質的相關去除研究，但通過生物，特別是昆蟲，對環(huán)境中的有害物質去除的研究相對較少。

本文總結了國內(nèi)外相關研究，對黑水虻等昆蟲處理有機廢棄物時重金屬、抗生素、細菌含量的變化及機理進行回顧和歸納。

1 重金屬

1.1 重金屬相關研究

Charlton等在研究昆蟲作為動物蛋白飼料的可行性，通過對加納地區(qū)生產(chǎn)的黑水虻進行重金屬含量分析，發(fā)現(xiàn)黑水虻對重金屬鎘存在一定的生物積累[27]。Diener等在相關研究基礎上，研究不同濃度下鉛（0、5.0、25.0、125.0 μg/g）和鎘（0、2.0、10.0、50.0 μg/g）對黑水虻的影響，鉛在黑水虻幼蟲體內(nèi)的殘留濃度均低于飼料中的起始濃度，在預蛹期鎘仍然在蟲體內(nèi)大量殘留BAF為2.32～2.94（bioaccumulation factor，BAF=蟲體內(nèi)重金屬濃度/飼料中重金屬濃度），到達成蟲后蟲體內(nèi)鉛和鎘濃度下降，BAF 降至0.12～0.21[28]。Fels 等在研究不同濃度鉛(2.50、5.00、10.00 mg/kg)和鎘(0.25、0.50、1.00 mg/kg)飼養(yǎng)下黑水虻幼蟲體內(nèi)的積累情況時，黑水虻幼蟲能有效減少飼料中鉛和鎘的濃度，富集指數(shù)BAF各濃度下最大的是鎘(9.5～6.9)，而之后是鉛(1.2～1.4)，并且幼蟲體內(nèi)的鎘含量高于飼料中的含量，鉛的蟲體內(nèi)含量卻與飼料相當，推測其可能與蟲體內(nèi)某些成分進行了有機結合[29]。Biancarosa 等利用巖衣藻(Ascophyllum nodosum)天然富集汞、鉛、鎘等重金屬的屬性，以其為飼料飼養(yǎng)黑水虻，檢測蟲體內(nèi)各重金屬的含量，發(fā)現(xiàn)黑水虻可以大量富集巖衣藻中的鎘[積累值最高為（93±5）%，累積值=蟲體內(nèi)重金屬濃度/飼料中重金屬濃度×100%]，對鉛（累積值最高為23%）和汞（累積值最高為37%）的富集作用比較弱。但由于與前者不同，Biancarosa使用的是巖衣藻富集后的重金屬離子測定黑水虻對重金屬的富集作用，較之前者認為添加的離子溶液混合飼料不同，在蟲體吸收上可能存在一定的區(qū)別，可能會存在某些物質促進或者抑制蟲體對重金屬元素的吸收[30]。Cai 等利用黑水虻處理城市污泥中的重金屬殘留，發(fā)現(xiàn)黑水虻對鉛[最高(416.6±7.9) mg/kg]、鎘[最高(2.2±0.1) mg/kg]、汞[最高(2.6±0.2) mg/kg]、鉻[最高(396.1±7.2) mg/kg]和銅[(632.6±12.2) mg/kg]等重金屬有較高的耐受能力，黑水虻能有效將污泥中的重金屬富集，且幼蟲提取油中含量極低，具備將處理完污泥的幼蟲油回收于工業(yè)利用的可能[31]。Gao等通過用不同濃度鎘（20、40、80 mg/kg）和鉻（100、200、300 mg/kg）飼料喂養(yǎng)黑水虻，研究兩種重金屬在黑水虻不同時期的分布，鎘在幼蟲（BAF=4.635）、預蛹期（BAF=4.198）在蟲體內(nèi)的濃度均高于飼料中的鎘濃度，在蟲蛹期（BAF=0.507）的濃度下降，而鉻卻正好相反，但在成蟲期后兩者的濃度均有一定程度的下降；在幼蟲和預蛹期鎘和鉻主要分布于蟲體內(nèi)而非外骨骼，但在蟲蛹期，在蛹殼的鎘和鉻濃度均高于蟲體內(nèi)，且兩者的濃度會隨著黑水虻的成長而降低；計算在理想情況下，400條黑水虻幼蟲可在12 d內(nèi)完全去除1 kg鎘含量4.5 mg/kg的干料[32]。Purschke等研究鉻、鎘、汞和鉛對黑水虻發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)該幾種重金屬影響黑水虻生長，鎘和鉛在蟲體內(nèi)積累較多，而其他重金屬蟲體內(nèi)濃度均低于原飼料中濃度[33]。同時也有報道稱黑水虻在預蛹期體內(nèi)會積累大量的帶磁性錳離子，可能與其體內(nèi)黑色素合成有一定聯(lián)系[34]。

1.2 降解機制

對于鎘在蟲體有較高的積累的情況，其實廣泛存在許多雙翅目昆蟲當中[28，35-39]。而像果蠅、蚊子這種雙翅目的昆蟲對鎘的攝入會提高體內(nèi)金屬硫蛋白的水平，金屬硫蛋白會與鉛結合造成體內(nèi)鉛的積累，同時對大多數(shù)的雙翅目昆蟲來說，這種蛋白是不會排出體外的[36，39]。還有報道稱黑水虻幼蟲的鈣含量高于許多雙翅目昆蟲，可能由于鎘與鈣擁有相似的離子半徑可以被熱休克蛋白通過鈣離子通道進行運輸[40-41]，因此它們對鎘有更強的累積效果[42]。Braeckman 等在雙翅目白紋伊蚊中發(fā)現(xiàn)HSP70蛋白家族中的一種蛋白，由體內(nèi)鎘濃度的提升所觸發(fā)產(chǎn)生，其作用主要是保護體內(nèi)其他蛋白免受隔的影響而變性[41]，這也許與黑水虻在高濃度鎘的影響下仍能存活有一定關系。Diener等研究發(fā)現(xiàn)黑水虻外骨骼中鉛含量高于蟲體內(nèi)鉛含量，推測鉛被代謝到外骨骼中進行隔離[28]。其實在昆蟲中也不乏這樣的例子：在喂食含鉛的飼料后，穴居蜉蝣的體外軀殼中含有大部分的鉛，而腸道中的鉛只有很少[43]；在綠紋蝗屬翅膀中鉛含量是腸道內(nèi)的四倍[44]。

黑水虻對鉛的代謝機制的研究仍處在探索階段，具體的機制仍未明確，但可以肯定的是黑水虻存在一套可以將腸道中的鉛以某種代謝方式排到外骨骼的機制，再通過蛻皮行為排出體外，而且過程中可能伴隨著鉛單質和離子間形態(tài)的轉變。在考慮黑水虻自身對重金屬的抵抗機制外，蟲體腸道菌群是否具有對重金屬離子吸附富集的作用，在該方面仍處于空白，但在其他方面關于細菌對重金屬的吸附的研究已經(jīng)頗為豐富。若能將兩者結合一起，將能夠吸附富集重金屬離子的細菌移植進入黑水虻體內(nèi)，是否有助于提高在高濃度重金屬下的黑水虻存活率與改善其發(fā)育情況，同時提高整體黑水虻對重金屬的富集與吸收。

2 抗生素

2.1 抗生素相關研究

Cai等研究了黑水虻對四環(huán)素的降解作用和降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)黑水虻腸道微生物是黑水虻降解四環(huán)素的關鍵因素，且腸道細菌可以把四環(huán)素降解速度加快一倍，腸道細菌的組成會隨四環(huán)素在飼料中的加入發(fā)生相應變化，且過程中四環(huán)素相關抗性基因表達量有明顯的上升[45]。Alyokhin 等在研究莫西菌素（moxidectin）對黑水虻發(fā)育的影響中，發(fā)現(xiàn)莫西菌素對黑水虻的生長有負面影響，在常用濃度莫西菌素下仍有30%的幼蟲能發(fā)育至成蟲[46]。黑水虻在抗生素降解領域的作用仍未被完全發(fā)掘，其自身對不同抗生素的藥敏性還有許多空白部分，在日常垃圾處理中的抗生素種類繁多且成分復雜，了解黑水虻對待不同抗生素的降解效果對日后其廢物處理的運用極為關鍵。在研究過程中黑水虻腸道微生物也應作為一個不可忽視的重要因素，深入對其進行研究。雖然有報道稱黑水虻腸道微生物有助于減少抗生素抗性基因[47]，但黑水虻腸道菌種中的抗生素抗性基因在黑水虻用作廢物處理過程中是否可能會通過某些途徑進入到自然環(huán)境中，增加細菌的耐藥性等問題仍需要更多深入的研究。

2.2 降解機制

在抗生素降解方面，相關的研究已經(jīng)非常繁多，但在黑水虻相關的降解機制上仍處于一片空白。目前能夠參考的文獻中，研究結果均表明：黑水虻降解抗生素的機制大部分歸功于其復雜的腸道菌群。有報道稱昆蟲幼蟲腸道由于圍食膜保護腸上皮細胞的原因對四環(huán)素幾乎不吸收[48]。昆蟲在四環(huán)素的降解上主要以腸道微生物、消化酶和免疫系統(tǒng)三者共同作用為主導[49-50]。

Zhang等利用雙翅目的家蠅降解豬糞堆肥當中的抗生素殘留，通過焦磷酸測序發(fā)現(xiàn)降解抗生素的主要為擬桿菌門、厚壁菌門和變形桿菌門[51]。在Prado等的研究中發(fā)現(xiàn)生物降解四環(huán)素的過程中降解前期存在一段延滯期，期間對四環(huán)素的降解效率幾乎為零[52]。由于四環(huán)素會影響細菌的30S核糖體亞基，延滯期原因可能是部分四環(huán)素對微生物生長的抑制作用[53]。Cai等研究結果表明，腸道分離出來的細菌在LB肉湯培養(yǎng)基中能快速降解四環(huán)素，但菌液和無菌黑水虻飼料混合喂食后，四環(huán)素降解率與單獨無菌黑水虻四環(huán)素降解率相當[45]，其中可能是因為細菌與黑水虻存在某種機制不明的頡頏作用[54]。

在黑水虻腸道菌群上由于其菌種構成的復雜性，研究難度大，但隨著基因測序技術的日漸成熟的，在其腸道微生物群體研究上也不斷深入。徐鍵研究發(fā)現(xiàn)其黑水虻腸道微生物構成與其飼料滅菌與否有直接關聯(lián)，且以摩根氏菌屬（Morganella spp.）和腸球菌屬（Trabulsiella spp.）為主[55]。Zheng 等對黑水虻發(fā)育全階段腸道菌群的變化做了詳細的研究，在黑水虻生命周期內(nèi)腸道內(nèi)主要以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides）為主，但在不同階段其占比各有不同，同時在成蟲時期疣微菌門（Verrucomicrobia）占比突然增大，而蟲卵期酸桿菌門（Acidobacteria）也有相當?shù)恼急萚56]。Cai等也發(fā)現(xiàn)四環(huán)素在飼料中的存在一定程度上會影響黑水虻腸道菌群的變化，并向著更耐四環(huán)素的方向進行改變：表現(xiàn)為擬桿菌屬的占比大幅提升和厚壁菌門變形菌門的減少，歸咎于四環(huán)素在幼蟲腸道中起到一個環(huán)境壓力的選擇作用[45]。江承亮在研究黑水虻降解餐廚垃圾時發(fā)現(xiàn)，黑水虻幼蟲腸道菌可通過入侵堆肥體生態(tài)位，對堆體菌群產(chǎn)生影響，堆體菌群可以同樣的方式影響腸道菌群，證明黑水虻腸道菌群是處于一個動態(tài)的變化中，并會受到環(huán)境因素所影響[57]。由此也可再次說明黑水虻腸道微生物中的抗性基因極有可能會進入到環(huán)境，造成嚴重的抗性基因傳播的問題，但若能把握好度，也存在通過將固定降解某種抗生素的多種菌投入到飼料中改變黑水虻腸道中的菌種構成，增加黑水虻對該種抗生素的耐性與降解作用，更好投入到未來廢物處理的利用中去。

3 抗菌活性物質

除了在重金屬和抗生素的去除上發(fā)揮作用，黑水虻還能有效降低廢物當中的致病菌的數(shù)量。Liu等研究發(fā)現(xiàn)通過黑水虻處理糞便能有效降低（數(shù)量級約為106CFU）其中大腸桿菌數(shù)量，并且最佳溫度為27 ℃，溫度是影響黑水虻降低糞便中大腸桿菌數(shù)量的重要因素[58]。Lalander等研究發(fā)現(xiàn)黑水虻處理后能有效降低廢物中的沙門氏菌（Salmonella spp.）和病毒фX174[59]。Erickson等研究發(fā)現(xiàn)黑水虻處理雞糞可以降低雞糞當中的大腸桿菌O157（Escherichia coliO157：H7）和沙門氏菌[60]。

在黑水虻降低廢物中的細菌數(shù)量的背后，必定有其相關的抑菌物質的產(chǎn)生與分泌，而黑水虻的抗菌物質首先由Choi等通過用酒精提取黑水虻幼蟲發(fā)現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)其對克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae）和宋氏志賀氏菌（Shigella sonnei）具有較強的抑制作用[61]。Park等也發(fā)現(xiàn)黑水虻的提取液對數(shù)種植物病原菌都有抑制作用，包括大蒜春腐?。≒seudomonas marginalis pv. marginalis）、番茄瘡痂病辣椒斑點?。╔anthomonas campestris pv. vesicatoria）、蔬菜的綠黃假單胞菌（Pseudomonas viridiflava）、煙草假單胞桿菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）、茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）和地毯黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. glycines）。還有報道稱黑水虻的提取物可以提高肉仔雞免疫力且提高仔雞對沙門氏菌的抵抗力[62]。Vogel等在研究不同飼料搭配下黑水虻抗菌肽分泌的影響，發(fā)現(xiàn)不同的飼料構成主要通過影響體內(nèi)免疫系統(tǒng)造成抗菌肽相關基因表達量的差異，在不同溶劑萃取下，對大腸桿菌（Escherichia coli）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）四種指示劑均表現(xiàn)出不同的抗菌性能，并推測抗菌肽基因的表達可能與飼料中的微生物構成和體內(nèi)核心構成微生物相關[63]。Barabas等證明了外源接種細菌同樣可以觸發(fā)黑水虻自身的免疫響應，表現(xiàn)為提高對大腸桿菌與藤黃微球菌生長的抑制力[64]。Park等利用酸性酒精對黑水虻抗菌物質進行提取研究其對數(shù)種細菌和真菌的抑制之作用，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、綠膿桿菌（seudomonas aeruginosa）、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、嗜根庫克菌（Kocuria rhizophila）、藤黃微球菌、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和白念珠菌（Candida albicans），并且成功利用高效液相色譜對抗金黃色葡萄酒菌的物質進行進一步純化，純化后抑制效果更顯著，推測提取液中存在不止一種抗菌物質，并且認為該提取液存在廣譜抗菌性[65]。Park等在此前研究的基礎上通過利用固相萃取和反向色譜并用的方法對黑水虻的抗菌物質進行純化和鑒定，鑒定為4 267 Da的肽分子，利用基質輔助激光離子化飛行時間型質譜儀（atrix- assisted laser desorption/ionization- time- offligh Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）對其氨基酸序列進行了測定，序列為ATCDLLSPFKVGHAACAAHCIARGKRGGWCDKRAVCNCRK，并成功在黑水虻基因找到對應的序列，并通過RT-PCR檢測了在黑水虻免疫前后該序列的表達量差異；該肽對基金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，但卻對革蘭氏陰性菌幾乎沒有抑制作用，而粗提取液則對兩者均有抑制作用，推測提取物中的抗菌物質不止一種[66]。

從目前已有資料來看，該種抑菌成分均大部分為肽鏈，且不同的肽對革蘭氏陰性菌與陽性菌的針對性各不相同，但對其抑制均表現(xiàn)出極強的作用，而且抗菌肽的另外一個好處是不易造成細菌的耐藥性，有望成為未來替代抗生素的一個重要分子；肽分子同時不需要進行復雜的空間折疊發(fā)揮其作用，有望在其他真菌上進行異源表達大規(guī)模產(chǎn)生該類肽分子。但上述研究當中許多都是用有機溶劑直接從黑水虻幼蟲中進行提取，而往往忽略了黑水虻腸道微生物的角色，他們只是發(fā)現(xiàn)抗菌物質來源于黑水虻，而沒有進行深入研究該種抗菌物質來源于黑水虻自身分泌還是腸道菌群中的某幾種菌所分泌，這是一個之后研究中值得深入研究的問題。

4 展望

黑水虻作為一種未來廢物處理的一大主角，其除了在廢物降解的效率和最適條件上，還有不可忽視的作用，那就是其對廢物當中的有害物質的降解。除了重金屬、抗生素和致病菌外還有諸如農(nóng)藥和霉菌毒素等多種成分復雜但卻不可忽視的有害物質。雖然有報道稱黑水虻對幾種霉菌毒素和農(nóng)藥存在一定的降解作用[33，67-69]。但目前相關領域仍存在大部分的空白，其背后的降解機制和積累效應仍未被詳細解析。這對日后將黑水虻用于動物飼料蛋白來源時是不得不考慮的問題。同時黑水虻的腸道菌群對人類來說就是一個寶庫，其中存在著大量的可利用的生物資源等待人類去發(fā)掘和利用，包括抗生素、農(nóng)藥和霉菌毒素等物質的降解細菌等。