關(guān)于豬瘟病毒Taqman實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法與臨床應(yīng)用的探討

馬 蘭

（哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

豬瘟病毒是一種小型單鏈RNA病毒，與牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral dirhea virus，BVDV）及羊邊界病毒（Borger disease virus，BVD）均屬于黃病毒科瘟病毒屬。而近年發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real-time fluorescent quantitativePCR）技術(shù)由于快速檢測(cè)微量的病毒核酸，可以準(zhǔn)確的確定病毒拷貝數(shù)的樣本，操作方便，耗時(shí)短，結(jié)果直觀，這么快就被廣泛使用在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文通過反復(fù)試驗(yàn)，成功建立了一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)特異性CSFV的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和樣品

從中牧實(shí)業(yè)股份有限公司購買豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖呼吸綜合征病毒（PRSV）、豬O型口蹄疫病毒（O-FMDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒II型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）等滅活疫苗，這些滅活疫苗經(jīng)多次凍融處理后，應(yīng)用RNA/DNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

主要試劑：磁珠法全自動(dòng)核酸提取試劑盒、世紀(jì)元亨豬瘟通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒；儀器：MagMAXTMExpress核酸提取儀、AB17500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 模板準(zhǔn)備

在MagMAXTMExpress核酸提取儀的幫助下，按照磁珠自動(dòng)核酸提取試劑盒的說明書提取PPVAPRVAPCV2的DNA和o=fmdvAPRRSVACSFV的RNA。提取的DNA/RNA用于PCR擴(kuò)增或-20c保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為1.000mg/mL的CSFV 1uL，作為實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，連續(xù)進(jìn)樣6次。x軸為CT值，y軸為Rn，用于CSFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的精密度驗(yàn)證。

1.2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取含有CSFV病毒的樣本和不含CSFV病毒的樣本各6份，每份1μl，濃度為1.000mg/ml，送至具有實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)。

1.2.4 特異性試驗(yàn)

以選擇的反應(yīng)體系和條件為參照，擴(kuò)增模板中制備的PPV、PRV、PCV2、o-fmdv、PRRSV、CSFV的DNA，并設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

精密度檢測(cè)結(jié)果顯示：第一次檢測(cè)CT值為23.1、第二次檢測(cè)CT值為23.2、第三次檢測(cè)CT值為23.3、第四次檢測(cè)CT值為23.2、第五次檢測(cè)CT值為23.6、第六次檢測(cè)CT值為23.5，變異系數(shù)為1.10%。

2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

與設(shè)計(jì)的一組樣本相比，測(cè)試結(jié)果基本一致，具有較好的CSFV檢測(cè)精度。

2.3 特異性試驗(yàn)

用本文方法擴(kuò)增含有CSFV的疫苗時(shí)，會(huì)出現(xiàn)陽性擴(kuò)增信號(hào)，而PPV、PRV、PCV2、0-fmdv、PRRSV的核酸模板沒有出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，說明該方法具有較好的特異性。

3 討論

對(duì)于中國養(yǎng)豬業(yè)而言，CSFV所造成的危害十分嚴(yán)重。目前，我國有大量的CSFV疫苗生產(chǎn)企業(yè)，但生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量差異非常明顯，往往出現(xiàn)免疫失敗。此外，CSFV的臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，缺乏典型病例?？焖?、特異、靈敏的分子生物學(xué)診斷方法的發(fā)展，有利于CSFV的快速檢測(cè)、CSFV病原陽性豬的清除和豬瘟的純化。將樣品中總RNA提取樣品，以樣品中的mRNA為模板。利用0ligo （dT）或隨機(jī)引物將逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板將PCR進(jìn)行擴(kuò)增，建立和應(yīng)用豬瘟病毒Taqman實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)，可以檢測(cè)到多種CSFV陽性樣品，但沒有CSFV的其他樣品沒有特異性擴(kuò)增，準(zhǔn)確度和精密度的檢測(cè)結(jié)果也是有效的，表明該方法具有較好的特異性、精密度和準(zhǔn)確度。

綜上所述，豬瘟病毒Taqman實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法，敏感性.特異性、準(zhǔn)確性好，是了解豬瘟病疫情流行狀況的有效手段，有助于更好地控制豬瘟的感染和流行。