細(xì)粒棘球蚴病的研究進(jìn)展

米吉提·莫合他爾汗

（新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯 木齊 830063）

囊型包蟲(chóng)病（Cystic echinococcosis），是由隸屬于帶科（Taeniidae）棘球?qū)伲‥chinococcus）的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcus gramsloses）的中絳期蟲(chóng)引起的一類人獸共患寄生蟲(chóng)病，該病呈世界性分布，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生[1]。細(xì)粒棘球蚴主要寄生于人、野生和家養(yǎng)的有蹄類動(dòng)物（中間宿主）的器官組織中，以肝臟最為常見(jiàn)，其次是肺部，并形成包囊[2]。

主要流行于牧區(qū)，不僅嚴(yán)重威脅牧民的生命健康，還給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失，該病的流行受生物、社會(huì)、環(huán)境等因素的影響，具有地方流行性，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)已經(jīng)將 棘球蚴病列入2012～2020年的《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃》中，作為重點(diǎn)防范和優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病。目前，在我國(guó)33個(gè)省/自治區(qū)當(dāng)中，已有20多個(gè)地區(qū)發(fā)布了感染病例的報(bào)道。

1 生活史

棘球絳蟲(chóng)必須依賴兩種哺乳動(dòng)物宿主才能完成其生活史。經(jīng)過(guò)蟲(chóng)卵，棘球蚴和成蟲(chóng)三個(gè)階段。成蟲(chóng)寄生于犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物的小腸內(nèi)，孕節(jié)片或蟲(chóng)卵隨糞便排出；細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵由有蹄動(dòng)物中間宿主食入蟲(chóng)卵，從而發(fā)育成棘球蚴，隨后 棘球蚴在肝、肺和其他臟器中發(fā)育生長(zhǎng)，直到棘球蚴被終宿主吞食后在其小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)。人感染棘球蚴后可在肝、肺等器官形成占位性病灶。

2 中間宿主

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)主要在家畜中循環(huán)，其中間宿主主要為有蹄類家畜（例如綿羊、牛、豬、山羊、馬、駱駝）。

3 終末宿主

狗、狼、狐、豺等為終末宿主。

4 包蟲(chóng)病的檢測(cè)技術(shù)

包蟲(chóng)病是我國(guó)西部地區(qū)農(nóng)牧民因病致貧和因病返貧的主要疾病之一，同時(shí)也是影響畜牧業(yè)發(fā)展的重要疾病。包蟲(chóng)病的中間宿主（包括人、牛、羊等）對(duì)人類的包蟲(chóng)病的免疫應(yīng)答研究較多，但大多涉及臨床癥狀表現(xiàn)后開(kāi)展的研究。對(duì)于患者的背景及感染劑量方面的研究報(bào)道較少，大多數(shù)包蟲(chóng)病手術(shù)患者在術(shù)后往往有繼發(fā)性感染的可能。同時(shí)，一般包蟲(chóng)病患者在進(jìn)行診治時(shí)，都已經(jīng)是患病的后期，在感染初期，患者很難被確診。目前，通常以影像學(xué)和免疫學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行包蟲(chóng)病的確診。也有很多分子生物學(xué)技術(shù)可用于包蟲(chóng)病診斷。

對(duì)中間宿主開(kāi)展免疫診斷時(shí)，可用囊液、粗提原頭節(jié)蛋自為包被抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)，粗提原頭節(jié)蛋自的敏感性和特異性較高?？乖瑽 （AgB）是由細(xì)粒棘球蚴病病原性幼蟲(chóng)產(chǎn)生的高豐度蛋白，是由原頭節(jié)和包囊合成和分泌的。E.gAgB具有很好的免疫原性，能夠識(shí)別出80%包蟲(chóng)病患者，在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有很重要的作用。E.g AgB家族在E.g差異表達(dá)的5個(gè)發(fā)育階段中至少含有10個(gè)單一基因。對(duì)兩個(gè)國(guó)家采集到的病理材料進(jìn)行分析，結(jié)果表明每一個(gè)基因在E.g幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)階段是完全相同的。將其DNA序列與Genbank上的基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谖錱發(fā)育過(guò)程中是高度保守區(qū)，但是E.g AgB具有明顯的變異和多態(tài)性。同時(shí)差異PCR結(jié)果顯示，這些基因在E.g生活史的不同階段的表達(dá)存在差異，只有E.gAgB3在所有生活階段都表達(dá)。

包蟲(chóng)病的檢測(cè)技術(shù)抑制差減雜交（suppressionsubtractive hybridization，SSH）是一種高效鑒定和分離克隆差異表達(dá)基因的新技術(shù)。該技術(shù)以高效、便捷和假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)受到廣大研究人員的重視，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，該技術(shù)在寄生蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用不是很多，主要應(yīng)用在尋找與寄生蟲(chóng)不同發(fā)育階段相關(guān)的差異表達(dá)基因和與寄生蟲(chóng)抗藥性相關(guān)的差異表達(dá)基因以及其他相關(guān)基因的研究，如與不同蟲(chóng)株、不同宿主或性別差異相關(guān)的基因。在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中，可通過(guò)此技術(shù)得到不同發(fā)育期差異表達(dá)的基因，并將這些基因用于診斷和防治包蟲(chóng)病。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time PCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加人熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累計(jì)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)特定數(shù)學(xué)原理對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。其熒光檢出方法可分為熒光嵌合法和熒光探針?lè)▋纱箢?。熒光嵌合法通常使用SYBRGreen I，它是一種能夠與所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域結(jié)合的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，它與PCR合成的雙鏈DNA結(jié)合，在激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光強(qiáng)度的監(jiān)測(cè)，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物量。熒光探針?lè)ㄍǔＪ褂盟馓结楾aqman探針，它是兩端標(biāo)記了熒光基團(tuán)的寡核昔酸探針，末端為淬滅基團(tuán)，末端為熒光基團(tuán)。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅，也稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence reso-nance energy transfer，F(xiàn)RET），當(dāng)進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的外切酶活性可切除探針，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離。常用的熒光基團(tuán)有FAM，V1C和NED等，淬滅基團(tuán)有TAMRA，DAB CYL和BHQ等。Realtime PCR是一種準(zhǔn)確、快速的核酸定量分析方法，也是定量研究基因表達(dá)水平最為有效的方法之一，這將為包蟲(chóng)病特異基因篩選提供有利的技術(shù)支撐。

5 單克隆抗體

動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，選擇性表達(dá)出不同基因的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)表達(dá)不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。

6 單克隆抗體的基本原理

要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。

7 單克隆抗體診斷的運(yùn)用

利用成蟲(chóng)抗原免疫動(dòng)物以獲抗體國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)多克隆抗體，有的用成蟲(chóng)多克隆抗體建立糞抗原檢測(cè)方法。國(guó)外已有檢測(cè)犬糞中成蟲(chóng)的商品試劑盒，其中有使用單克隆抗體的也有使用多克隆抗體的。但是多克隆抗體批次與批次問(wèn)的特異性與親和力不同，抗原抗體容易形成格了結(jié)構(gòu)（沉淀反應(yīng)），特異性低。單克隆抗體則特異性識(shí)別單一抗原決定簇，特異性高，抗體均一。用單克隆抗體建立的檢測(cè)方法具有上述的優(yōu)點(diǎn)，有著多克隆抗體無(wú)法相比的優(yōu)勢(shì)，本研究利用雜交瘤技術(shù)建立了1株能持續(xù)穩(wěn)定分泌抗包蟲(chóng)成蟲(chóng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)蟲(chóng)體抗原與原頭節(jié)蟲(chóng)體抗原之問(wèn)存在著很高的交義反應(yīng)，不同的組分主要在成蟲(chóng)有孕節(jié)及內(nèi)含的蟲(chóng)卵，表明這兩采用Th1類細(xì)胞因了IFN-γ，IL-2等的編碼基因作為基因佐劑與保護(hù)性蛋白編碼基因串聯(lián)裝入含有CMV強(qiáng)啟動(dòng)了質(zhì)粒pcDNA。

總之，從我國(guó)對(duì)家畜包蟲(chóng)病防控工作已取得的成果表明，只要阻斷細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)循環(huán)鏈中終末宿主家/牧犬排泄蟲(chóng)卵（傳染源），便可控制包蟲(chóng)病的傳播。即通過(guò)實(shí)施“犬犬投藥，月月驅(qū)蟲(chóng)”控制模式，就可使新疆包蟲(chóng)病在很短時(shí)間內(nèi)由高發(fā)控制到低水平。