豬流行性腹瀉病毒診斷方法及防控措施

翟豫文 段靜茹 黎 明 劉俊山 劉 朔

(1.漯河市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南漯河 426000;2.漯河市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心,河南漯河 426000)

1 RT-PCR方法

隨著近幾年P(guān)CR技術(shù)的不斷發(fā)展和更新，豬流行性腹瀉病的診斷效率也得到快速有效的提高。以豬流行性腹瀉病毒基因序列為基礎(chǔ)建立的RT-PCR檢測方法對細胞分離株和臨床樣品的糞便進行檢測。韓國Kim O等人將此項技術(shù)更進一步推進，在發(fā)現(xiàn)豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病易混合感染時，建立了同時診斷這兩種病毒的二重RT-PCR方法。此外，國外還有學(xué)者在此基礎(chǔ)上建立了可以同時檢測三種病毒的檢測方法以及檢測豬流行性腹瀉病的實時熒光PCR檢測方法。與熒光檢測方法相應(yīng)的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)也成為了一種新的檢測手段被廣泛應(yīng)用。PCR檢測方法雖然有著良好的敏感性和特異性，但是由于所用的設(shè)備和人員操作的限制，只能適用于實驗室診斷，不適合基層檢測使用。

2 ELISA檢測方法

近幾年檢測技術(shù)的發(fā)展日新月異，除了分子生物學(xué)檢測方法外，還有常用的血清學(xué)檢測方法，如ELISA方法。ELISA檢測方法具有特異性高，靈敏度高、操作簡便，結(jié)果判定容易等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于大批量樣品的檢測。ELISA檢測方法不但可以對抗體進行檢測，還可以對抗原進行檢測。此外，在實驗室和現(xiàn)場檢疫均適用。ELISA檢測方法也是世界衛(wèi)生組織公認的國際標準之一。ELISA檢測方法的種類非常多，常見的有雙夾心ELISA方法、競爭ELISA方法、間接ELISA方法、斑點ELISA方法等。其中豬流行性腹瀉病毒的N蛋白、S蛋白和M蛋白常用來作為抗體建立ELISA檢測方法。

3 免疫熒光法

在豬流行性腹瀉病毒的檢測方法當中，免疫熒光方法是一種常用的特異性強、靈敏度高的方法，同時也是研究人員用以驗證新方法建立的輔助方法。如任曉峰在建立的豬流行性腹瀉病毒M蛋白檢測抗體ELISA方法的基礎(chǔ)上，用間接免疫熒光方法驗證了含有豬流行性腹瀉病毒蛋白檢測抗體ELISA的基礎(chǔ)上，用間接免疫熒光實驗證實。豬流行性腹瀉病毒膜蛋白血清能夠與Vero細胞進行反應(yīng)，取豬腸道組織切片經(jīng)過熒光抗體染色后，2小時內(nèi)就可以得到結(jié)果。免疫熒光檢測方法靈敏度高，但是對樣品要求非常高，不適合在實踐中批量檢測[1]。

4 電鏡法

利用電鏡方法觀察，可以清晰的看到病毒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)、形狀，進而判定病毒的類型。豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎屬于同一個病毒屬，而且都可以引發(fā)不同日齡的豬只發(fā)病，因為兩種病毒引起的豬腹瀉的臨床癥狀比較類似，很難從發(fā)病豬臨床上診斷出來病種類型，但是電鏡觀察法可以有效地、直接地觀察和鑒別出是哪一種病毒引起的發(fā)病。其中，豬流行性腹瀉 病毒粒子的纖突頂球較小，底部較為短，排列非常密集，這與傳染性胃腸炎的病毒粒子區(qū)別也非常小，且兩種病毒粒子并沒有免疫交叉反應(yīng)，這證明兩種病毒粒子沒有共同的抗原。電鏡方法簡單、直觀、快捷，但是電鏡方法設(shè)備繁瑣，不適用于大規(guī)模、大批量檢測。

5 免疫組化法

最早的免疫組化是利用噬菌體抗體系統(tǒng)在單克隆抗體的基礎(chǔ)上對PEDV建立了免疫組化方法，這個實驗嚴證實了該抗體作為免疫組化檢測一抗的可行性。免疫組化方法檢測的靈敏度非常高，能夠較好的對豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉病進行有效區(qū)分。但是該檢測方法所需時間較長，成本非常高，在大批量的檢測當中并不適用。

6 血凝試驗

豬流行性腹瀉病毒不具有血凝作用，因此無法進行血凝試驗。但是可以用豬流行性腹瀉病毒致敏醛化鞣酸化細胞，由此建立一種豬流行性腹瀉病毒的間接血凝試驗。

7 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

科研工作者針對豬流行性腹瀉病毒的N基因設(shè)計了6對引物，建立了檢測豬流行性腹瀉病毒的等溫擴增技術(shù)。這種檢測技術(shù)只需要63℃反應(yīng)50min，然后凝膠電泳即可看到結(jié)果，相對于ELISA和RT-PCR方法，更為快捷簡便。

8 免疫防控措施

豬流行性腹瀉病的防控主要是以預(yù)防為主，在日常生產(chǎn)中要提高飼養(yǎng)管理水平，做好圈舍和場地的消毒工作、病豬的隔離工作。對于進出豬場的人員和車輛要嚴格進行消毒，對于患病豬群要及時進行分欄處理。另外，也是最為重要的，就是用商品化的疫苗來預(yù)防豬流行性腹瀉病的發(fā)生，常用的疫苗有組織滅活苗、細胞弱毒苗和轉(zhuǎn)基因疫苗。組織滅活苗主要是讓仔豬口服豬流行性腹瀉病毒毒株，等仔豬出現(xiàn)臨床癥狀后，剖檢取出豬腸內(nèi)容物，將其搗碎，制作成乳劑，混合甲醛滅活后與氫氧化鋁佐劑混合一起制作成滅活疫苗。雖然這種方法切實有效，但是制作疫苗的成本較高，不適合被廣泛應(yīng)用。隨著疫苗的需求不斷加大，各種弱毒苗也紛紛被研究出來，尤其是病毒在細胞上傳代次數(shù)達到一定量時，病毒會有一定的致弱現(xiàn)象，從而獲得弱毒疫苗。弱毒疫苗的應(yīng)用所產(chǎn)生的免疫保護作用與接種劑量有直接的關(guān)系。低劑量的疫苗免疫保護率較低，高劑量的疫苗，免疫保護率較高。隨著基因載體系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，豬流行性腹瀉病的轉(zhuǎn)基因疫苗被作為一個新的研究方向開發(fā)出來，試驗證明，轉(zhuǎn)基因疫苗可以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，起到一個很好的免疫保護作用。