胚挽救技術(shù)在葡萄育種上的研究及應(yīng)用

梁樹樂(lè)，李 林，遲曉紅，劉少杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái)264670）

無(wú)核葡萄是重要的鮮食葡萄品種。美國(guó)鮮食葡萄市場(chǎng)上80%是無(wú)核的，98%的葡萄干是用無(wú)核葡萄生產(chǎn)的。在我國(guó)，鮮食葡萄的無(wú)核特性也越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，無(wú)核葡萄的種植面積也在逐年增加，品種從單調(diào)轉(zhuǎn)向多樣化。產(chǎn)生無(wú)核葡萄有2種途徑：一是在葡萄果實(shí)生長(zhǎng)前期，用赤霉素進(jìn)行處理，但是赤霉素的處理濃度不易掌握，處理效果不穩(wěn)定，同時(shí)比較費(fèi)工，葡萄的品質(zhì)也會(huì)有所下降；另一種是直接培育無(wú)核葡萄品種。因此，優(yōu)質(zhì)無(wú)核葡萄品種的培育，已成為葡萄育種者的共同目標(biāo)之一[1]。為避免葡萄胚在發(fā)育過(guò)程中，無(wú)核葡萄品種的合子胚敗育，傳統(tǒng)的無(wú)核葡萄育種方法，只能用有核葡萄品種作為母本、無(wú)核品種作為父本來(lái)獲得雜交種子。然而，這種雜交方法具有較少的無(wú)核后代，并且育種效率非常低，平均僅為13.5%[2]。而使用胚培養(yǎng)技術(shù)，可以通過(guò)使用無(wú)核葡萄作母本、有核葡萄作父本，或者利用無(wú)核葡萄與無(wú)核葡萄雜交的方法，有效地增加了雜種后代的無(wú)核比率。該方法的無(wú)核比率可達(dá)50%以上。自從RAMMING等[3]于1982年首次使用胚挽救技術(shù)以來(lái)，以無(wú)核葡萄作為母本的雜交成為現(xiàn)實(shí)，無(wú)核后代的比例得到了提高，從而使這種葡萄育種技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用[4-12]。我國(guó)自20世紀(jì)80年代開始進(jìn)行胚挽救的研究，發(fā)展迅速，國(guó)內(nèi)部分高校和科研院所，通過(guò)胚挽救技術(shù)進(jìn)行無(wú)核葡萄的育種工作，研究影響胚挽救的因素主要包括基因型、胚珠的接種時(shí)期、珠被處理方式、剝離后幼胚的培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境、組培苗移栽等方面，使胚挽救育種技術(shù)體系不斷豐富和完善，大大縮短了無(wú)核葡萄的育種周期，充分說(shuō)明利用胚挽救技術(shù)獲得無(wú)核葡萄新品種，是完全可行并具有重要意義[13-23]。

1 胚挽救概述

無(wú)核葡萄根據(jù)其來(lái)源可以分為2類：一類是子房未經(jīng)受精發(fā)育成無(wú)胚果實(shí)，稱單性結(jié)實(shí)[24]；另一類是雖然受精，受精后胚很快停止發(fā)育而導(dǎo)致無(wú)核果實(shí)產(chǎn)生，稱假單性結(jié)實(shí)，無(wú)核葡萄中超過(guò)85%的為假單性結(jié)實(shí)類型。假單性結(jié)實(shí)葡萄的幼胚可以在停止發(fā)育之前，將胚從幼果中取出，然后在體外進(jìn)行培養(yǎng)，以發(fā)育成成熟胚，進(jìn)而在試管中培育成完整的植株?？梢钥闯?，胚挽救是指由于營(yíng)養(yǎng)或生理原因，在胚發(fā)育的早期階段，胚敗育最終難以形成幼苗，而需要在敗育前將胚進(jìn)行早期體外培養(yǎng)。無(wú)核葡萄胚培養(yǎng)的步驟通常分2步進(jìn)行，以無(wú)核葡萄作母本，授粉后30～60 d，此時(shí)無(wú)核葡萄胚很小，很難在胚珠中分離，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)也是非常困難的，通常需要先將胚珠培養(yǎng)一段時(shí)間，然后將胚珠中的胚芽剝離，再接種到培養(yǎng)基上以促進(jìn)胚的萌發(fā)和幼苗形成。這種2步胚培養(yǎng)的方法，正日益成為無(wú)核葡萄胚挽救過(guò)程中的常規(guī)技術(shù)措施。

2 影響無(wú)核葡萄胚挽救的因素

胚挽救技術(shù)難度較大，需要嚴(yán)格操作。而且每個(gè)環(huán)節(jié)都受到很多因素的影響，直接影響胚萌發(fā)的效率?？傮w來(lái)說(shuō)，主要包括以下幾個(gè)因素。

2.1 親本基因型

親本的基因型對(duì)胚挽救的成功影響很大，特別是母本的基因型，母本胚的可挽救性直接決定胚挽救的效率。胚的發(fā)育受基因型控制，品種不同形成合子胚的能力不同。白柯林斯、黑柯林斯和紅柯林斯等單性結(jié)實(shí)品種不會(huì)形成合子胚，因此，它們不能用作雜交的母本[25]。大約85%的假單性結(jié)實(shí)品種如無(wú)核白、奧蘭多無(wú)核、萊克蒙特等受精很容易形成合子胚，可以作為母本使用[26]。然而，不同品種形成合子胚的能力也不同,在同一采樣期內(nèi)，利用相同的培養(yǎng)基成分，以火焰無(wú)核為母本，進(jìn)行胚培養(yǎng)，胚萌發(fā)率以及成苗率明顯高于以Perlette和Sultanina為母本；GOLDY[27]采用離體胚培養(yǎng)了10個(gè)無(wú)核葡萄品種的胚珠，結(jié)果顯示，胚萌發(fā)率從0（Reliance）到45%（Venus）不等。紅寶石無(wú)核葡萄是一種假單性結(jié)實(shí)品種，具有相對(duì)較大的胚珠，縱向直徑可達(dá)3.48 mm，這為胚挽救的成功提供了先決條件。此外，父本對(duì)胚發(fā)育率和萌發(fā)率也有顯著影響，不同父本對(duì)胚發(fā)育率、萌發(fā)率和成苗率的影響均有顯著差異。無(wú)核葡萄自交后，胚的成苗率一般不高。因此，在利用胚挽救培育無(wú)核葡萄時(shí)，率先使用無(wú)核性狀傳遞力強(qiáng)的葡萄品種作父本，如無(wú)核白和無(wú)核黑等。

2.2 培養(yǎng)基種類及激素選擇

培養(yǎng)基對(duì)未剝離胚珠的發(fā)育以及不同發(fā)育階段的成熟胚培育有重要的影響。一般認(rèn)為，胚發(fā)育的基本培養(yǎng)基使用Nitsch或NN較好[28]，1/2 MS培養(yǎng)基用于胚萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。在胚培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加0.3%左右的活性炭[29]，可有效防止胚培養(yǎng)期間的褐變。

蔗糖被用作胚挽救的能量來(lái)源，同時(shí)可以保持適當(dāng)?shù)臐B透壓，這有利于無(wú)核葡萄的胚胎培養(yǎng)。在無(wú)核葡萄未成熟胚的挽救初期，蔗糖濃度通常較高，含有6%蔗糖的培養(yǎng)基，可促進(jìn)無(wú)核葡萄胚和胚珠生長(zhǎng)更快，胚珠質(zhì)量增加[30]；在胚挽救的后期，將蔗糖的濃度降低為2%[31]，有利于胚萌發(fā)及成苗。

不同的激素類型、濃度對(duì)胚萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響很大[32]，其中，以赤霉素和生長(zhǎng)素最為重要，添加IAA 10-5mol/L和GA310-6mol/L到Nitsch培養(yǎng)基中，對(duì)于無(wú)核葡萄品種的胚挽救至關(guān)重要[33]，如果不添加IAA和GA3，再生率非常低，僅為3%～5%。GA3可以促進(jìn)根莖的生長(zhǎng)，而幼苗的正常生長(zhǎng)可以促進(jìn)胚胎的早期萌發(fā)。IAA和IBA可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，抑制莖和幼苗過(guò)度生長(zhǎng)。添加KT和ZT可以增加胚的存活概率，這與誘導(dǎo)細(xì)胞分裂有關(guān)，2，4-D可以促進(jìn)體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。因此，為了達(dá)到預(yù)期的效果，胚挽救時(shí)，必須注重選擇合適的激素類型和用量。

2.3 接種時(shí)期

胚培養(yǎng)的取樣和接種期非常重要，一般認(rèn)為，當(dāng)胚發(fā)育程度最高且尚未敗育時(shí)接種效果最好[34]。因此，確定胚珠接種的最佳時(shí)期，是胚挽救成功的前提和關(guān)鍵；同一品種胚的敗育并不是同步的，每個(gè)品種胚都有一個(gè)急劇敗育時(shí)期，而不同品種胚的急劇敗育期則不同[21]。然而，當(dāng)胚胎發(fā)育階段較高時(shí)，進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單且易于成苗。通常以開花后的天數(shù)或者授粉后的天數(shù)作為接種期的依據(jù)，用來(lái)反映胚珠的發(fā)育程度[11]。不同品種雜交組合，胚挽救的時(shí)期不同，一般在授粉后20～50 d。然而，胚珠在不同品種、不同部位、不同年份、不同氣候條件其發(fā)育水平是不同的[35]，而開花后天數(shù)的定義可能會(huì)影響胚挽救效果的穩(wěn)定性。由于胚的發(fā)育與果實(shí)成熟期密切相關(guān)，因此，一些研究人員使用漿果開始著色期作為形態(tài)指標(biāo)來(lái)確定最佳的胚挽救接種期。

2.4 培養(yǎng)環(huán)境的影響

無(wú)核葡萄的胚挽救也受到光、溫度和濕度等培養(yǎng)條件的影響。其中，溫度是胚挽救成功的重要條件。在離體胚胎的拯救中，利用最佳溫度并保持恒溫，可使培養(yǎng)物加速生長(zhǎng)。通常（25±2）℃的溫度適合大多數(shù)植物，葡萄適合25～28℃。光照促進(jìn)植物胚的發(fā)育及生長(zhǎng)，在胚挽救過(guò)程中，光強(qiáng)度為2 000～3 000 μmol/（m2·s），光照為每天12 h。一般認(rèn)為，光照促進(jìn)胚芽生長(zhǎng)，而黑暗利于胚根生長(zhǎng)[36]。在胚珠內(nèi)源培養(yǎng)階段中，交替光照和黑暗為好，一般光周期為12～16 h，光強(qiáng)為50～100 μmol/（m2·s），培養(yǎng)時(shí)間是 56～84 d[37-39]。

3 葡萄育種中的胚挽救應(yīng)用

3.1 早熟葡萄的選育

胚挽救技術(shù)在早熟葡萄育種方面顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)，在葡萄雜交育種中，后代的成熟期有趨于早熟的趨勢(shì)，特別是當(dāng)2個(gè)親本的成熟期接近或早熟的品種用作母本時(shí)，這種趨勢(shì)更為明顯[42]，這有利于早熟葡萄的培育。由于早熟品種生長(zhǎng)期短，胚發(fā)育較差，因此，不容易形成飽滿的種子。而對(duì)于早熟葡萄，采用胚挽救的育種，目前已取得了一定的成果[40-42]。

3.2 無(wú)核葡萄的培育

胚挽救作為一種高效的育種技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于葡萄無(wú)核育種。無(wú)核品種的培育主要采用胚培養(yǎng)技術(shù)，以無(wú)核作為母本，無(wú)核或有核作為父本進(jìn)行雜交，可有效提高雜交后代的無(wú)核率。目前，通過(guò)胚挽救技術(shù)已選育出了數(shù)十種新的無(wú)核葡萄品系。國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者也正在利用這種手段進(jìn)行無(wú)核葡萄的選育，到目前為止，法國(guó)[43]、美國(guó)[44]、日本[45]、中國(guó)[46]等許多國(guó)家創(chuàng)造出了大量的無(wú)核葡萄新種質(zhì)。

3.3 遠(yuǎn)緣雜交育種的應(yīng)用

由于遠(yuǎn)緣雜交親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，植物組織或器官如胚、胚乳和子房之間缺乏協(xié)調(diào)，從而導(dǎo)致部分或全部胚壞死。受精后的幼胚停止發(fā)育或敗育，以至于很難獲得雜交苗。而遠(yuǎn)緣雜交獲得的雜交胚通過(guò)胚挽救，則可以增加所獲得雜種苗的比例。如圓葉葡萄（Vitis rotundfolia，2n＝40）抗病性強(qiáng)，對(duì)葡萄根瘤蚜免疫，在葡萄的抗病性育種中作為重要的雜交親本而被歐美葡萄育種家應(yīng)用，但由于圓葉葡萄和真葡萄亞屬（2n＝38）內(nèi)的葡萄種類親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，染色體數(shù)不同。因此，在常規(guī)育種中難以獲得雜交種子或雜交苗，為培育抗病葡萄品種，利用圓葉葡萄作親本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交受到了廣泛關(guān)注。1989年，GOLDY等[47]利用胚挽救技術(shù)，獲得無(wú)核葡萄和圓葉葡萄的雜種苗，從而實(shí)現(xiàn)抗病基因在無(wú)核葡萄中的滲透。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交建立了新的育種方法，將抗病基因和無(wú)核基因有效聚合到一起。

3.4 多倍體育種

多倍體植物重要的特點(diǎn)是器官的巨大性，通過(guò)葡萄多倍體育種可以獲得大粒品種，20世紀(jì)40年代就已開始果樹的多倍體育種，并取得了一些進(jìn)展。葡萄中最有價(jià)值的多倍體是三倍體和四倍體，大多三倍體葡萄是粒大無(wú)核的，四倍體葡萄是粒大、少核或無(wú)核的。通常三倍體是通過(guò)四倍體和二倍體雜交獲得的，但由于染色體數(shù)量不同，胚和胚乳發(fā)生敗育，不能得到有生活力的種子，然而通過(guò)胚挽救技術(shù)可以克服敗育的障礙。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)潘春云等[48]利用二倍體葡萄與四倍體雜交，通過(guò)胚挽救培育出2個(gè)三倍體葡萄新品系。日本育種專家YAMASHITA等[49-51]較早通過(guò)胚培養(yǎng)獲取三倍體葡萄品種。由于二倍體和四倍體之間的雜交，合子胚會(huì)早期退化。因此，獲得三倍體后代的目標(biāo)可以通過(guò)二倍體和四倍體雜交結(jié)合胚挽救技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

4 葡萄胚挽救育種的前景

世界上100多個(gè)無(wú)核葡萄品種中的大多數(shù)現(xiàn)在來(lái)自無(wú)核白、無(wú)核紫或其衍生的無(wú)核品種，并且基因型相對(duì)簡(jiǎn)單。作為一種經(jīng)濟(jì)、高效、快速的無(wú)核葡萄育種方法，胚培養(yǎng)在過(guò)去的20a中發(fā)展迅速。自20世紀(jì)80年代后期以來(lái)，我國(guó)的高校及科研院所對(duì)無(wú)核葡萄胚胎培養(yǎng)的研究已經(jīng)開展，亓桂梅[52]、徐海英等[53]、王躍進(jìn)等[54]、劉小寧等[55]、郝燕等[56]、蔣愛(ài)麗等[57]、李世誠(chéng)等[58]對(duì)無(wú)核葡萄的胚培養(yǎng)技術(shù)做了大量的工作，并培育出一些新種質(zhì)。由于無(wú)核葡萄的選育周期長(zhǎng)，傳統(tǒng)雜種后代性狀的鑒定需要6 a以上。目前，在常規(guī)雜交育種的基礎(chǔ)上，配合分子標(biāo)記輔助育種，可以大大加快葡萄育種的進(jìn)程。通過(guò)分子標(biāo)記可以把雜種進(jìn)行早期選擇，把與目標(biāo)性狀不密切相關(guān)的雜種從后代群體中淘汰掉，有利于提高無(wú)核葡萄育種的效率。在過(guò)去的10 a中，DNA標(biāo)記技術(shù)在葡萄無(wú)核品種的選擇上取得了很大進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外的研究人員開始專注于構(gòu)建分子標(biāo)記和遺傳圖譜，獲得與無(wú)核基因相關(guān)的DNA分子標(biāo)記，葡萄無(wú)核性狀的提早檢測(cè)極大地加速了胚挽救的進(jìn)程。