羅伊氏乳桿菌在炎癥性腸病糞菌移植中的作用R

黃軍祥, 汪輝玉, 周春立, 龐 智, 徐雄飛

(江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū) 消化內(nèi)科, 江蘇 蘇州, 215008)

炎癥性腸病(IBD)是一類以腸道慢性、非特異性炎癥為主要特征的疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)及克羅恩病(CD)。IBD臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉及便血，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。在未來，中國IBD患病率最高可能達(dá)到0.1%, 2025年的患病人數(shù)將超過150萬，幾乎與西方國家發(fā)病率持平[1]。IBD發(fā)生、發(fā)展與免疫異常調(diào)節(jié)、遺傳易感性、腸道菌群紊亂、腸道持續(xù)感染、慢性腸黏膜屏障損傷、飲食等因素有關(guān)。在目前所有有關(guān)IBD的治療方法中，糞菌移植(FMT)具有重要的作用，在臨床上已廣泛應(yīng)用于治療IBD、難治性艱難梭狀芽孢桿菌感染、腹瀉型及便秘型腸易激綜合征、胰島素抵抗的糖尿病、肥胖癥等，并取得了一定的療效[2]。2013年，美國首次將FMT方案列入臨床治療復(fù)發(fā)性艱難梭狀芽孢桿菌感染(rCDI)的指南[3]。張發(fā)明等[4]率先在中國針對嚴(yán)重CD合并腸瘺感染患者開展了FMT治療。最新的研究結(jié)果顯示FMT存在以下問題: ① 質(zhì)量和安全性難以控制; ② FMT過程復(fù)雜; ③ 糞便菌群不能長期保存; ④ 供體篩選流程復(fù)雜。因此，建立適合IBD患者最佳的腸道微環(huán)境，維持腸道微生態(tài)，就顯得尤為重要。腸道益生菌L.reuteri可在腸道內(nèi)持續(xù)定植[5]，通過改變腸道內(nèi)微環(huán)境來預(yù)防和阻止炎癥性腸病的發(fā)生;L.reuteri還可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)一類特殊的免疫細(xì)胞—雙陽性上皮內(nèi)T細(xì)胞(DPIELs), DPIELs是由CD4+T細(xì)胞分化而來，與腸道免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，可增強(qiáng)免疫系統(tǒng)耐受性，調(diào)節(jié)過于活躍的免疫反應(yīng)，減輕IBD患者的腸道炎癥反應(yīng)[6]。

1 腸道微生態(tài)參與IBD發(fā)病機(jī)制

1.1 腸道微生態(tài)的建立和細(xì)菌分布特點(diǎn)

人的腸道是不同微生物的共同“棲息地”，這些微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌等，數(shù)量約100兆，比人體細(xì)胞總數(shù)10倍還要多[7-8]。目前研究[9-10]普遍認(rèn)為，人類腸道內(nèi)微生物的定植是嬰兒在分娩過程中從產(chǎn)道、皮膚、糞便以及出生后母乳喂養(yǎng)中開始形成的。據(jù)估計(jì)，人體腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量超過1 000種，其中大多數(shù)為專性厭氧菌，包括厚壁菌、擬桿菌、變形菌和放線菌[11]。厚壁菌屬(革蘭陽性菌)和擬桿菌屬(革蘭陰性菌)是所有哺乳動物的主要門類，超過腸道內(nèi)菌群的90%[12]。細(xì)菌的總數(shù)和組成在人體胃腸道內(nèi)不同部位有所不同，如胃和小腸的上段的細(xì)菌分布就較少。值得注意的是，腸道內(nèi)細(xì)菌組成的變化可通過不同的信號通路影響腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。腸道內(nèi)細(xì)菌主要負(fù)責(zé)對碳水化合物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFAs)進(jìn)行降解，促進(jìn)維生素K、維生素B12、葉酸以及氨基酸的合成，并調(diào)節(jié)脂肪代謝，有助于維持腸道屏障功能的完整性[13]。腸道中的細(xì)菌可通過抑制病原菌的定植和產(chǎn)生抗菌化合物來保護(hù)腸道上皮免受病原體的侵害，保護(hù)腸黏膜屏障，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[14]。

1.2 腸道微生態(tài)紊亂與IBD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

IBD發(fā)病的影響因素包括腸道微生物群及其代謝物的紊亂、宿主的遺傳易感性、宿主的先天和后天性免疫[15-16]等。腸道微生態(tài)與IBD的關(guān)系有: ① 動物實(shí)驗(yàn)[17]證實(shí)，腸道菌群在IBD的發(fā)病機(jī)制有重要的作用，因?yàn)樵跓o菌動物模型中不能誘發(fā)結(jié)腸炎; ② IBD患者糞便和腸道黏膜中微生物群的生物多樣性減少，并有異常成分[16]; ③ 腸道微生物群的代謝物紊亂(如丁酸鹽代謝異常)涉及到IBD的發(fā)病[18]; ④ 一些益生菌產(chǎn)品可以有效地減輕腸道癥狀，預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎的復(fù)發(fā)[19]; ⑤ 一些抗生素可能引起并維持IBD的緩解[20]; ⑥ 許多環(huán)境因素如西方化的飲食、現(xiàn)代的生活方式或?yàn)E用抗生素等，會對腸道菌群的組成產(chǎn)生重要影響，導(dǎo)致IBD的發(fā)病率顯著增高[21]。

國外研究[22]使用16S rRNA為基礎(chǔ)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(SSCP)、16S rRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)(T- RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT- PCR)和高通量測序等技術(shù)，其結(jié)果證實(shí)，與健康個(gè)體相比, IBD患者的微生物群多態(tài)性明顯較少，腸道常發(fā)生微生態(tài)失衡，即有害菌超過有益菌，以脆弱擬桿菌和腸桿菌數(shù)量增加為主，尤其是大腸埃希菌。Walker等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在IBD患者的炎性與非炎性反應(yīng)區(qū)，厚壁菌數(shù)量下降，而擬桿菌數(shù)量上升，細(xì)菌分布也存在著顯著差異。因此，腸道微生態(tài)改變與IBD發(fā)生和病情發(fā)展密切相關(guān)，盡管目前還無確切證據(jù)說明哪種特定的病原體導(dǎo)致IBD發(fā)生，然而在IBD患者中使用益生菌確實(shí)獲得了一定的療效。

2 FMT在IBD治療中的應(yīng)用

FMT本質(zhì)是重建腸道菌群平衡，修復(fù)由抗生素導(dǎo)致的菌群紊亂，其最強(qiáng)的適應(yīng)證是難治性艱難梭菌感染。對于IBD, FMT能改善IBD患者紊亂的腸道微生態(tài)，補(bǔ)充IBD患者減少的腸道共生菌，調(diào)節(jié)腸屏障功能和通透性，并參與腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)。

FMT首次被報(bào)道是在1958年, Eiseman等[24]報(bào)道了4例對抗生素治療無反應(yīng)的偽膜性結(jié)腸炎患者資料，所有患者在糞便保留灌腸后完全痊愈。在過去的幾十年中, FMT已經(jīng)被申請用于難治性梭狀芽胞桿菌感染的治療，并被認(rèn)為是治療IBD的一個(gè)潛在方法。1989年Bennet等[25]在Lancet上發(fā)表了FMT在IBD中最早應(yīng)用的個(gè)案報(bào)道, Bennet自身患UC 7年，期間不能耐受柳氮磺胺吡啶類和激素，他嘗試使用大量糞液保留灌腸, 3個(gè)月后腸鏡檢查顯示急性炎癥消退, 6個(gè)月后癥狀基本消失。首例個(gè)案報(bào)道雖然帶來了陽性的結(jié)果，但I(xiàn)BD是活動期和緩解期交替的，半年的隨訪并不能證實(shí)FMT的長期有效性。2003年, 一項(xiàng)回顧性分析[26]表明, 6例難治性UC患者采用連續(xù)5 d糞液保留灌腸，此后1～13年隨訪中，患者病情基本緩解，表明FMT治療的長期有效性。Anderson等[27]系統(tǒng)性地回顧分析了FMT在IBD患者中應(yīng)用的文獻(xiàn)報(bào)道，共包含41例IBD患者(27例UC、12例CD、2例非定型)，隨訪期從2周到13年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMT可以使63.0%的IBD患者達(dá)到臨床緩解，而76.0%的患者可以停止服用IBD相關(guān)的藥物，并且消化系統(tǒng)癥狀減少。國內(nèi)一項(xiàng)研究[28]回顧總結(jié)了12份報(bào)告，發(fā)現(xiàn)FMT治療成人的總體成功率為77.8%。通過衡量癥狀的消失或潰瘍性結(jié)腸炎的活動指數(shù)的減少(UCAI), FMT改善UC的成功率約為90.0%。對于難治性IBD, 與傳統(tǒng)療法如抗感染、類固醇、免疫抑制和生物制劑等相比, FMT可能是一種較為理想的治療方案。

3L.reuteri與IBD

3.1 L. reuteri的特性與功效

L.reuteri屬于乳桿菌屬，為革蘭陽性菌，屬兼性厭氧菌，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為輕微不規(guī)則、圓形末端的彎曲桿菌，屬專性特異型發(fā)酵菌種，能發(fā)酵糖產(chǎn)生二氧化碳(CO2)、乳酸、乙酸等，與廣泛存在于脊椎動物和哺乳動物腸道內(nèi)的乳酸桿菌具有良好的生物相容性，對人體無毒害，不會導(dǎo)致疾病發(fā)生[29-30]。L.reuteri在人的腸胃中天然存在，是少量適應(yīng)定植在人腸胃的乳酸桿菌之一，其可以定植在胃酸和膽鹽的環(huán)境中，承受胃酸汁液和膽汁酸，而到達(dá)小腸上部，則可黏附在小腸壁。L.reuteri作為重要的益生菌之一，具有如下功能: ① 調(diào)整腸道菌群平衡，抑制腹瀉。L.reuteri在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫、細(xì)菌素等多種拮抗物質(zhì)，可以有效地抑制體內(nèi)有害菌的生長和繁殖，抑制由抗生素等引起的腹瀉。② 黏附在宿主消化道內(nèi)并定植和存活下來形成生物屏障，一方面可以抑制病原菌在消化道黏膜上的黏附，并通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)而抑制病原菌的生長; 另一方面可以防止毒素等有害物質(zhì)的吸收并中和有毒產(chǎn)物。③ 產(chǎn)生獨(dú)特的抑菌素，抑制有害菌。L.reuteri能通過代謝甘油產(chǎn)生一種特殊的抑菌物質(zhì)羅伊氏素(reuterin), 主要成分是3- 羥基丙醛(3- HPA)的單體、水合物及環(huán)化二聚體, 3- HPA是一種低分子量的非蛋白、中性、可溶性的細(xì)菌素。Axelsson L T等[31]研究表明,L.reuteri有很寬的抑菌譜帶，較低濃度即可抑制多種有害病原菌的生長，如大腸埃希氏桿菌、鼠傷寒桿菌、白假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌、黃曲霉菌、空腸彎曲桿菌及產(chǎn)芽孢梭菌等病菌。④ 刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫功能，抑制有害菌，維護(hù)胃腸道平衡。L.reuteri產(chǎn)生酸性環(huán)境，從而抑制有害微生物的生長和繁殖，可有效避免沙門氏桿菌的感染，并幫助維持腸道菌群的正?；iu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，多種人源L.reuteri(包括DSM17938、ATCC PTA4659、ATCC PTA 5289、ATCC PTA6475等)均可通過單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)來刺激免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，進(jìn)而不同程度地減輕人類腸道炎癥程度。⑤ 抗過敏。過敏反應(yīng)是人類常見自身免疫性疾病,L.reuteri有預(yù)防腸道過敏反應(yīng)以及調(diào)節(jié)腸道的免疫功能作用[33]。

3.2 L. reuteri在IBD 中的定植

IBD是一種慢性胃腸道疾病，病因尚不十分清楚，其中環(huán)境因素特別是腸道微生物引起的復(fù)雜免疫反應(yīng)是導(dǎo)致其發(fā)病的一個(gè)重要誘因。L.reuteri與IBD關(guān)系的研究是近些年的研究熱點(diǎn)，但目前相關(guān)的研究報(bào)道并不多。Ott S J等[34]研究顯示, IBD患者腸道微生物多樣性較正常人明顯減少，原因是類桿菌、真桿菌和乳酸桿菌明顯缺失，這會直接導(dǎo)致腸道黏膜的炎癥反應(yīng)，包括腹瀉和腸黏膜的出血。Schreiber O等[5]研究顯示，在大鼠模型中，葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎會引起乳酸桿菌的定植增加，這可能與腸黏膜功能受打擊有關(guān)。通過連續(xù)給予4株乳酸桿菌，其中包括L.reuteriR2lc菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L.reuteriR2lc菌株在大鼠結(jié)腸黏液中定植，可預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生，并顯著減輕腸黏膜炎癥反應(yīng)。Petrella C[35]研究也顯示,L.reuteri的2個(gè)不同菌株ATCC PTA 4659(人類的起源)和R2lc(嚙齒類動物的起源)在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中均有減少。上述研究都強(qiáng)調(diào)了L.reuteri的抗感染潛力，連續(xù)補(bǔ)充益生菌幾乎完全阻止了DSS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[5], 考慮與益生菌腸道內(nèi)持續(xù)定植有關(guān)。

3.3 L. reuteri在IBD腸道免疫調(diào)節(jié)中的作用

腸道免疫調(diào)節(jié)是由數(shù)以萬億計(jì)的微生物及許多模式受體基因產(chǎn)物相互作用而保證的，目的是維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其中這些受體就包括C型凝集素受體(CLRs)[36]、特定的細(xì)胞間黏附分子3(SIGNR3)[37]。腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境是受腸道免疫信號通路嚴(yán)格調(diào)控的，這種免疫機(jī)制可減輕IBD患者的腸道炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸黏膜屏障功能，當(dāng)調(diào)節(jié)機(jī)制破壞時(shí)，將不可避免地導(dǎo)致IBD的發(fā)生。IBD患者腸道炎癥正是由于腸道免疫系統(tǒng)過度活躍引起的[38]。

腸道細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)主要是受淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)影響。研究[39]報(bào)道小鼠腸道內(nèi)分布不同上皮內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群。在αβT淋巴細(xì)胞亞群中，雙陰性T細(xì)胞和CD8αα+T細(xì)胞在大腸中分布比例較高, CD8αα+T細(xì)胞在小腸中較高，而雙陽性上皮內(nèi)T細(xì)胞在小腸遠(yuǎn)端較高; 在γδT淋巴細(xì)胞亞群中, CD8αα+T細(xì)胞在小腸中分布較高，雙陰性T細(xì)胞在大腸中較高。腸道免疫細(xì)胞DPIELs為鼠和人類共有，研究L.reuteri對明確DPIELs特殊調(diào)節(jié)機(jī)制及IBD患者治療提供了新方向。

2017年，來自華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究[6]顯示,L.reuteri是一種可以調(diào)節(jié)DPIELs的腸道微生物; 研究人員將大鼠隨機(jī)分為大量DPIELs組與不含DPIELs組，將攜帶DPIELs組腸道菌群移植給另一組小鼠，結(jié)果顯示該組小鼠也含有相當(dāng)數(shù)量的DPIELs, 再經(jīng)過4種抗生素處理后，小鼠體內(nèi)DPIELs又消失了，表明腸道菌群在參與腸道免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用。在對新霉素有抗藥性的腸道內(nèi)革蘭陽性菌中，在大鼠體內(nèi)經(jīng)過逐個(gè)的細(xì)菌移植，研究[19]發(fā)現(xiàn)只有L.reuteri能決定CD4+T細(xì)胞是否能分化為DPIELs, 其他的5類擬桿菌目細(xì)菌均無此作用，表明L.reuteri有抑制有害菌的作用。菌群的紊亂可加重腸道的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)IBD。

IBD與腸道的免疫和微生物菌群密切相關(guān)，色氨酸(Trp)是一種炎癥抑制因子，是腸道菌群的調(diào)節(jié)劑。研究[40]發(fā)現(xiàn)，在小鼠結(jié)腸炎模型中，通過添加Trp可降低蘇氨酸、蛋氨酸及脯氨酸譜來調(diào)節(jié)血清氨基酸譜，影響腸道免疫功能，同時(shí)可抑制白介素- 22在結(jié)腸中表達(dá)，改變腸道微生物群。

關(guān)于L.reuteri是如何讓T細(xì)胞分化為DPIELs的問題, Colonna研究[6]顯示L.reuteri可通過代謝Trp而產(chǎn)生吲哚- 3- 乳酸，并激活CD4+T細(xì)胞中的芳香烴受體，從而引起轉(zhuǎn)錄因子Thpok表達(dá)的減少，使CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步分化為DPIELs，這與Reis等[41]發(fā)現(xiàn)的Thpok下調(diào)引導(dǎo)的分化機(jī)制是一致的。同時(shí)，該研究將大鼠分為3組，分別以高水平Trp(0.48%)、標(biāo)準(zhǔn)水平Trp(0.24%)和低水平Trp(0.11%)飲食喂養(yǎng)4周，對于移植了缺陷型L.reuteri菌株的無菌小鼠而言，即使補(bǔ)充高水平的Trp也不能升高小鼠DPIELs的水平；而對于普通L.reuteri水平正常的小鼠而言，標(biāo)準(zhǔn)Trp水平喂養(yǎng)的DPIELs是低水平的2倍，高水平的則達(dá)到3倍; 表明這些大量存在于健康人腸道的有益菌若想發(fā)揮特殊的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，需要人體必需氨基酸之一的Trp的參與。目前尚不清楚在正常機(jī)體中誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的發(fā)育是否與L.reuteri產(chǎn)生的Trp有關(guān)，但在炎癥性腸病患者中發(fā)現(xiàn)與Trp代謝相關(guān)基因缺陷[6]。

3.4 L. reuteri在IBD中應(yīng)用潛力

目前通過FMT植入益生菌可以重建或調(diào)整腸道微生物菌群、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，減少炎癥因子的釋放以及參與腸黏膜免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療IBD的功效。L.reuteri作為腸道益生菌，不但能抑制有害菌生長，減輕腸道炎癥反應(yīng)，而且可以上調(diào)小腸中DPIELs的水平，參與腸道微生態(tài)及免疫機(jī)制調(diào)節(jié)[5-6, 33]。

4 展 望

本綜述對L.reuteri在IBD中糞菌移植中的作用做了總結(jié)，分析國內(nèi)外大量基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果，認(rèn)為L.reuteri具有建立或調(diào)整腸道微生物菌群、預(yù)防或治療因腸道感染引起的腹瀉、調(diào)節(jié)腸道免疫功能的功效，但還需要在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳特性及基因調(diào)控等方面展開更深入的研究。