人源酸敏感離子通道1a介導(dǎo)酸引起細(xì)胞凋亡的研究

徐媛媛，李文娜，翟玉榮，莫鎮(zhèn)濤，李意奇，李俊明，肖 璐，李彩蘭

(遵義醫(yī)科大學(xué) 珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

酸敏感離子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是一類配體門控Na+通道，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。能被酸激活產(chǎn)生內(nèi)向電流，對陽離子透過能力Na+>Ca2+>K+>H+[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)，ASICs有6個亞型(ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3以及ASIC4)，其中，ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b在中樞神經(jīng)元表達較多[3-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在大腦缺血過程中，ASIC1a被酸激活，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進一步引起神經(jīng)元損傷，在大腦中動脈閉塞(MCAO)引起的腦缺血模型中，通過注射ASIC1a特異性阻斷劑可以減少梗死面積，因此，ASIC1a是介導(dǎo)酸引起神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵亞型，ASIC1a有望作為減輕酸引起神經(jīng)元損傷的新型分子靶點[5-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，人源與小鼠源ASIC1a有98%氨基酸序列相同，另2%氨基酸決定人源與小鼠源ASIC1a在功能的差異：對CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染人源或小鼠源ASIC1a基因，結(jié)果顯示，與小鼠源ASIC1a相比，人源ASIC1a介導(dǎo)酸引起的膜電流增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，繼而引起細(xì)胞損傷加重，導(dǎo)致這些功能存在差異的機制是由于人源ASIC1a的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運效率更高，進一步發(fā)現(xiàn)第285位氨基酸是決定人源與小鼠源ASIC1a膜轉(zhuǎn)運差異的關(guān)鍵氨基酸位點[8-9]。雖然人源ASIC1a比小鼠來源ASIC1a介導(dǎo)由酸引起的細(xì)胞損傷更大，但并沒有進一步證明是何種損傷，細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死？因此本課題旨在比較：在不同種類細(xì)胞中，人源與小鼠源酸敏感離子通道1a(ASIC1a)介導(dǎo)酸引起的細(xì)胞凋亡，為開發(fā)ASIC1a特異性阻斷劑提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗細(xì)胞及質(zhì)粒：CHO細(xì)胞、COS7細(xì)胞(購于ATCC)，新生小鼠品系為野生型C57BL/6(購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)，人源ASIC1a(hASIC1a)、小鼠源ASIC1a(mASIC1a)、GFP質(zhì)粒(GFP)(美國南阿拉巴馬大學(xué)查向明教授惠贈)。主要試劑：F12、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，碘化丙啶、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒、Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)，Neurobasal、B27、Opti-MEM和胎牛血清(Gibco)，Sulfo-NHS-Biotin和NeutrAvidin Beads(Pierce)，MTT試劑盒(Sigma)，山羊來源ASIC1和小鼠來源Tubulin一抗(Santa Cruz)，二抗(Thermo Fisher Scientific)。主要儀器：熒光顯微鏡(Olympus)，酶標(biāo)儀(Molecular Device)，免疫印跡實驗儀(Bio-Rad)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞培養(yǎng)基為F12加10%的胎牛血清，COS7細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM加10%胎牛血清，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，對細(xì)胞進行傳代，將細(xì)胞種植在96孔板或60 mm培養(yǎng)皿中，次日，用Lipofectamine2000混合目標(biāo)質(zhì)粒，按比例(2∶1)對CHO細(xì)胞或COS7細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，ASIC1a與GFP 質(zhì)粒DNA比例為(3∶1)，總量為0.125～0.25μg /孔或2～5μg /60 mm培養(yǎng)皿。4～6 h之后，加入正常培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染效率達到80%以上可用于后續(xù)實驗。

1.3 原代皮層錐體神經(jīng)元培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取新生鼠，分離皮層組織，加入0.075%胰酶，37℃，消化2 min。加入10%馬血清終止消化，低速離心，棄上清。吹散種植液懸浮的組織團，收集上層細(xì)胞，低速離心，種植液重懸細(xì)胞沉淀，活細(xì)胞計數(shù)，種植神經(jīng)元，3～4 h后，換培養(yǎng)液。后續(xù)每3天半量換液，7 d可進行轉(zhuǎn)染。用CaCl2對神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒的實驗方法，在EP管中加入15 μg 目標(biāo)質(zhì)粒，40 μL H2O，85 μL 50 M CaCl2，混合均勻后加到含125 μL HBS的EP管中，室溫孵育30 min。將混合好的DNA、CaCl2混合物感染神經(jīng)元，每孔25 μL，DNA量為1.5 μg/孔。轉(zhuǎn)染時間為1 h，換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，被轉(zhuǎn)染過的神經(jīng)元用于后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞酸處理與PI染色 對細(xì)胞或神經(jīng)元進行酸處理，用pH7.4或pH6.0 ECF緩沖溶液處理COS7細(xì)胞和神經(jīng)元，分別用pH7.4或pH6.0或pH6.0+PcTx-1 ECF緩沖液處理CHO細(xì)胞，酸細(xì)胞處理2 h、神經(jīng)元1 h，酸處理之后換回正常培養(yǎng)基，次日PI染色、拍照。經(jīng)酸處理的COS7細(xì)胞和神經(jīng)元，加入PI溶液，孵箱孵育10 min，轉(zhuǎn)染ASIC1a和GFP的細(xì)胞呈綠色熒光，凋亡細(xì)胞被PI標(biāo)記呈紅色熒光，統(tǒng)計PI陽性細(xì)胞比率=黃色細(xì)胞數(shù)量/綠色細(xì)胞數(shù)量。

1.5 熒光顯微鏡拍照 經(jīng)過酸處理的CHO細(xì)胞，24 h之后綠色熒光細(xì)胞丟失，通過熒光顯微鏡拍照，計算細(xì)胞死亡率，實驗方法見文獻[8,10]，計算公式為：細(xì)胞死亡率%=(pH7.4細(xì)胞數(shù)量-pH6.0細(xì)胞數(shù)量)/pH7.4細(xì)胞數(shù)量×100%，或(pH7.4細(xì)胞數(shù)量-pH6.0+PcTx-1細(xì)胞數(shù)量)/pH7.4細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.6 MTT實驗 在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入500 μg/mL MTT溶液，3～4 h后，加入150 μL DMSO室溫震蕩15 min，測定在570 nm波長的吸光度。以正常對照組培養(yǎng)物吸光值作為100%，處理組培養(yǎng)物吸光度占對照組吸光度的比值反映細(xì)胞存活情況。

1.7 細(xì)胞膜蛋白表面生物素標(biāo)記以及親和素沉淀分離 經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，加入1.5 mL，0.5 mg/mL Suflo-NHS-LC-生物素溶液，4℃旋轉(zhuǎn)孵育30 min，加入甘氨酸終止反應(yīng)，加入300 μL NeutrAvidin緩沖液，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日，其中200 μL混合蛋白的NeutrAvidin緩沖液再混合40 μL鏈親和素瓊脂糖珠，用于膜蛋白分離，另外100 μL為總蛋白，進行Western blot實驗。經(jīng)蛋白定量，加入上樣緩沖液，制膠，電泳，電轉(zhuǎn)，封閉，孵育一抗，抗體稀釋比例：ASIC1(1∶1 000)、tubulin(1∶30 000)，潤洗，孵育二抗(anti-goat 1∶12 000，anti-mouse 1∶12 000)，潤洗，顯影，進行蛋白定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗分為采用成對T檢驗來檢查兩組數(shù)據(jù)的差異，數(shù)據(jù)的表示方式采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(MEAN±S.E.M)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的COS7細(xì)胞凋亡比較 結(jié)果顯示(見圖1)，轉(zhuǎn)染鼠ASIC1a的細(xì)胞經(jīng)pH6.0處理之后，PI陽性細(xì)胞比率為(24.7±2.1)%，轉(zhuǎn)染人ASIC1a的細(xì)胞經(jīng)pH6.0處理之后，PI陽性細(xì)胞比率為(37.3±4.3)%，與鼠ASIC1a相比，PI陽性細(xì)胞比率顯著性增加(P<0.05)。

轉(zhuǎn)染ASIC1a呈綠色，PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞為紅色，顏色合并，與鼠ASIC1a相比，*：P<0.05；n= 5。圖1 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的COS7細(xì)胞凋亡比較

2.2 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的神經(jīng)元凋亡比較 結(jié)果顯示(見圖2)，轉(zhuǎn)染鼠ASIC1a的神經(jīng)元經(jīng)pH6.0處理之后，PI陽性細(xì)胞比率為(18.7±3.3)%，轉(zhuǎn)染人ASIC1a的神經(jīng)元經(jīng)pH6.0處理之后，PI陽性細(xì)胞比率為(38.8±6.1)%，與鼠ASIC1a相比，PI陽性細(xì)胞比率顯著性增加(P<0.05)。

轉(zhuǎn)染ASIC1a呈綠色，PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞為紅色，顏色合并，與鼠ASIC1a相比，*：P<0.05；n= 5。 圖2 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的神經(jīng)元凋亡情況比較

2.3 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的CHO細(xì)胞損傷比較 結(jié)果顯示(見圖3)，轉(zhuǎn)染鼠ASIC1a的細(xì)胞死亡率為(20.7±2.0)%，轉(zhuǎn)染人ASIC1a細(xì)胞死亡率為(42.1±3.0)%，與鼠ASIC1a相比，細(xì)胞死亡率增加，且具有顯著性差異(P<0.001)；運用ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1，可顯著性減少人源與鼠源ASIC1a由pH6.0引起的細(xì)胞損傷(P<0.05，P<0.001)。

與鼠ASIC1a相比，###：P<0.001，n=10，19；鼠ASIC1a，與pH6.0相比，*：P<0.05，n=23；人ASIC1a，與pH6.0相比，***：P<0.001，n=14。圖3 人ASIC1a與鼠ASIC1a介導(dǎo)酸引起的CHO細(xì)胞損傷情況比較

2.4 轉(zhuǎn)染人源ASIC1a 的CHO細(xì)胞活力降低 結(jié)果顯示(見圖4)，轉(zhuǎn)染鼠源ASIC1a的細(xì)胞，細(xì)胞活力百分比為(78.9±2.1)%，轉(zhuǎn)染人源ASIC1a的細(xì)胞活力百分比為(55.3±2.7)%，二者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；運用ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1，可顯著性增加細(xì)胞活力百分比(P<0.05)。

與鼠ASIC1a相比，###：P<0.001，n=4；鼠ASIC1a，與pH6.0相比，*：P<0.05，n=8；人ASIC1a，與pH6.0相比，**：P<0.01，n=8。圖4 轉(zhuǎn)染人源ASIC1a 的CHO細(xì)胞活力

2.5 人源ASIC1a在CHO細(xì)胞膜表達 結(jié)果顯示(見圖5)，人ASIC1a膜蛋白表達量是鼠ASIC1a的3.5倍(P<0.05)，說明人源ASIC1a細(xì)胞膜表達更多。

Surface ASIC1a表示細(xì)胞膜上的ASIC1a的量，Total ASIC1a表示總ASIC1a的量，surface除以 Total代表ASIC1a往細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運率，與鼠ASIC1a相比，*：P<0.05，n=4。圖5 人源ASIC1a比鼠ASIC1a在細(xì)胞膜表達

3 討論

前期對ASIC1a的研究，主要集中在嚙齒類動物，對人源ASIC1a的研究較少，動物實驗研究中，ASIC1a阻斷劑顯著改善缺血性壞死，但卻沒有基于該藥理作用的藥物投入臨床，原因是由于ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1是南美一種蜘蛛提取的毒素，不宜大量運用于人體，并且 PcTx-1大量的合成、穩(wěn)定性以及能否透過血腦屏障這些問題都給其臨床應(yīng)用帶來困難[11]。此外，人源與小鼠源ASIC1a存在2%氨基酸序列的差異，ASIC1a在不同物種間的表達、分布、亞單位結(jié)合、生理性質(zhì)以及藥理學(xué)性質(zhì)都存在差異[12]。

本文通過對COS7細(xì)胞/CHO細(xì)胞/原代皮層錐體神經(jīng)元轉(zhuǎn)染人或小鼠ASIC1a質(zhì)粒，經(jīng)酸pH6.0處理之后，對比細(xì)胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染小鼠源ASIC1a的COS7細(xì)胞和神經(jīng)元相比，轉(zhuǎn)染人源ASIC1a的COS7細(xì)胞和神經(jīng)元，由酸引起的細(xì)胞PI陽性細(xì)胞比率更大，細(xì)胞死亡率更高，細(xì)胞活力更低，且ASIC1a特異性阻斷劑PcTx-1能顯著逆轉(zhuǎn)由酸引起的細(xì)胞凋亡。因此得出結(jié)論，人源ASIC1a比小鼠源ASIC1a介導(dǎo)由酸引起的細(xì)胞凋亡越大。

本文通過PI染色、MTT實驗研究酸引起的細(xì)胞凋亡，最好再通過細(xì)胞流式或者檢測細(xì)胞因子的水平，比如，IL-1β、TNF-α、Caspase3等[13]，這都是未來我們需要完成的實驗。此外，在腦缺血病理狀態(tài)下，ASIC1a介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，可以通過鈣成像實驗比較人源與鼠源ASIC1a引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化情況。本文的圖5結(jié)果說明人源ASIC1a比鼠ASIC1a在細(xì)胞膜表達更多，那么我們可以假設(shè)人源ASIC1a比鼠源ASIC1a介導(dǎo)的膜電流更大，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度更高，這些假設(shè)都將在我們接下來的實驗中進行驗證。

通過這一系列的基礎(chǔ)研究，我們明確ASIC1a介導(dǎo)酸引起的細(xì)胞凋亡，進一步通過研究ASIC1a介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制，對藥物的理性篩選更有指導(dǎo)意義，為防治缺血性腦卒中提供重要的理論依據(jù)。