間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用研究

肖昆林，張蕊，張維杰，馬建兵*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 西安 710054)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性病變，以軟骨丟失、軟骨下骨異常改變、滑膜炎及骨贅形成為特征，常常引起受累關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，OA已經(jīng)成為中老年人生活質(zhì)量下降和致殘的首要原因[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，我國(guó)將成為世界OA患病人數(shù)最多的國(guó)家[2]。骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康和生活，給社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的OA治療方法，如功能鍛煉、理療、改變生活方式和使用止痛藥物等，都只能暫時(shí)緩解癥狀，而不能治療OA的發(fā)病機(jī)制或逆轉(zhuǎn)OA的進(jìn)程。對(duì)于較嚴(yán)重的病例，只能采取關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，如截骨矯形術(shù)、關(guān)節(jié)鏡手術(shù)和關(guān)節(jié)成形術(shù)。盡管關(guān)節(jié)置換手術(shù)比較有效，但是患者的不滿意度仍高達(dá)30%，而且這種方法有一定的使用年限，使用過(guò)程中需要復(fù)雜的維護(hù)，并且這種方法不適合活動(dòng)量較大的年輕患者[3-4]。因此，尋找一種新的骨關(guān)節(jié)炎治療方法一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的特點(diǎn)及直接應(yīng)用MSCs對(duì)OA的治療

1.1 MSCs的特點(diǎn)及分類(lèi) 近年來(lái)，隨著對(duì)干細(xì)胞研究領(lǐng)域的深入，MSCs用于骨關(guān)節(jié)炎的治療引起人們?cè)絹?lái)越多的重視。MSCs可以自骨髓、脂肪組織、臍帶、外周血、滑膜及其他組織中分離得到[5]，是一類(lèi)具有自我更新能力的多潛能祖細(xì)胞，可以分化成多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[6]。由于MSCs較容易獲得、對(duì)供體的影響小，分化能力強(qiáng)，不僅有助于組織修復(fù)，而且還具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，已經(jīng)被廣泛用于各種疾病的治療，包括對(duì)軟骨退行性疾病OA的治療。

1.2 直接應(yīng)用MSCs對(duì)OA的治療

1.2.1 治療種類(lèi) 目前，直接應(yīng)用MSCs對(duì)OA進(jìn)行治療包括基于組織工程支架的MSCs植入術(shù)和直接將MSCs注入到受損關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔中。前者主要應(yīng)用于修復(fù)受損比較嚴(yán)重的關(guān)節(jié)面軟骨組織，后者主要應(yīng)用于早期OA的治療。兩種方法在OA動(dòng)物模型上都取得了良好的治療效果。在臨床上也有病例報(bào)道，影像學(xué)顯示OA疾病表現(xiàn)得到了改善，問(wèn)卷調(diào)查顯示OA患者滿意度得到了提高[7]。

1.2.2 治療優(yōu)勢(shì)及存在問(wèn)題 MSCs細(xì)胞由于比較容易獲得、增殖能力強(qiáng)，以及在一定的條件下可以定向分化為軟骨細(xì)胞和軟骨組織，在治療軟骨退行性疾病OA方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)和實(shí)際的治療效果。近年來(lái)，許多臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)都證明，間充質(zhì)干細(xì)胞療法治療軟骨損傷和OA是一種很有前景的新治療方法。但幾乎所有間充質(zhì)干細(xì)胞都有其自身的局限性，如分離采集和運(yùn)輸要求條件高、對(duì)供體的年齡要求較高以及體外培養(yǎng)增殖能力有限等，極大地限制了其臨床應(yīng)用。此外，干細(xì)胞的數(shù)目和修復(fù)能力也會(huì)隨著人體正常的新陳代謝而相應(yīng)地減低，最終會(huì)影響干細(xì)胞的活性以及療效。MSCs等干細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代的過(guò)程中也會(huì)不斷地衰老，從而喪失其多向分化潛能。因此，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的治療，尋找一種易采集、性質(zhì)穩(wěn)定、免疫原性低、作用效果好的干細(xì)胞替代品以彌補(bǔ)以上的不足成為近幾年人們關(guān)注的焦點(diǎn)。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MSCs不僅能通過(guò)自身增殖分化替代受損組織，還可以分泌一種重要的微環(huán)境調(diào)控物質(zhì)—外泌體，實(shí)現(xiàn)對(duì)OA疾病的修復(fù)治療作用。

2 外泌體的來(lái)源及組成

生物體內(nèi)除了一些特殊的細(xì)胞可以釋放一些分泌小泡，例如激素及神經(jīng)遞質(zhì)外，所有的細(xì)胞都可以分泌細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)。這種分泌過(guò)程從細(xì)菌到植物和人高度保守[8]。EV最初被認(rèn)為是細(xì)胞排除內(nèi)部代謝廢物的一種方式，現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)EV的作用更多的是在細(xì)胞之間進(jìn)行物質(zhì)交換，這些交換的物質(zhì)包括核酸、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)。這些物質(zhì)在細(xì)胞之間進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，維持細(xì)胞正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定或者顯示細(xì)胞的病理狀態(tài)。根據(jù)來(lái)源不同，EV主要分為細(xì)胞囊泡和外泌體。細(xì)胞囊泡直徑大致在50～500 nm之間，來(lái)源于細(xì)胞膜和融合物向膜外方向分離，釋放到細(xì)胞外。外泌體直徑大致為50～150 nm，由細(xì)胞膜包裹內(nèi)含物向細(xì)胞質(zhì)方向內(nèi)陷分離，釋放到細(xì)胞外。

外泌體是具有雙層脂膜結(jié)構(gòu)的微型囊泡，來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)的多泡體(multivesicular body，MVB)，其內(nèi)含有多種蛋白質(zhì)、核酸及脂類(lèi)等物質(zhì)，核酸包括mRNA及microRNA[9]。外泌體在細(xì)胞間信息交流的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，許多細(xì)胞類(lèi)型，包括干細(xì)胞、B和T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、血小板和腫瘤細(xì)胞都可以分泌外泌體，人們?cè)诖蠖鄶?shù)體液如血液、尿液、腦脊液、母乳和唾液中也發(fā)現(xiàn)了外泌體[10]。

3 MSCs來(lái)源的外泌體及其對(duì)OA的治療

3.1 MSCs來(lái)源的外泌體 通過(guò)質(zhì)譜分析和微陣列進(jìn)行的詳細(xì)分析顯示MSCs外泌體攜帶有復(fù)雜的核酸(mRNA和miRNA)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。MSCs是間質(zhì)支持細(xì)胞，主要用于維持體內(nèi)組織微環(huán)境以獲得最佳的組織功能，其外泌體含有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和酶，可調(diào)節(jié)和恢復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的穩(wěn)態(tài)[9]。越來(lái)越多的研究表明，MSCs對(duì)疾病的治療效果主要是通過(guò)旁分泌的作用實(shí)現(xiàn)的。這主要是基于注入體內(nèi)的MSCs在體內(nèi)移植和停留的時(shí)間有限，MSCs以旁分泌的方式發(fā)揮了其治療作用，這種作用通過(guò)外泌體調(diào)節(jié)相應(yīng)組織中的細(xì)胞而完成[11-13]。實(shí)際上，一些研究已經(jīng)揭示，在一些疾病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，外泌體作為潛在的治療手段促進(jìn)了創(chuàng)傷后組織的再生和修復(fù)，包括創(chuàng)傷性腦損傷、肺動(dòng)脈高壓、創(chuàng)傷愈合等[14-16]。對(duì)于OA的治療表明，MSCs外泌體可以介導(dǎo)軟骨的修復(fù)和再生，改善OA癥狀及延緩OA疾病的進(jìn)展。

3.2 MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)軟骨缺損的治療 Zhang等[17]首次證明了人類(lèi)胚胎MSCs外泌體對(duì)軟骨組織的修復(fù)作用。該研究在12只成年SD大鼠股骨遠(yuǎn)端的滑車(chē)溝制作骨軟骨缺損模型，然后在每只動(dòng)物缺損一側(cè)的關(guān)節(jié)內(nèi)注射外泌體，另一側(cè)注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)作為對(duì)照。6周和12周后外泌體處理的缺損組較PBS組在外觀和組織學(xué)評(píng)分方面都有了明顯的改善。特別是12周后，外泌體處理的缺損組表現(xiàn)出軟骨和軟骨下骨的完全修復(fù)，其特征包括具有規(guī)則表面的透明軟骨，完全粘附到鄰近軟骨，并且ECM沉積非常類(lèi)似于年齡匹配的未處理對(duì)照組。相反，對(duì)側(cè)PBS處理的缺損組僅表現(xiàn)為纖維軟骨修復(fù)。該研究表明了MSCs外泌體作為軟骨再生和ECM合成的無(wú)細(xì)胞療法的效用。

3.3 MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)OA的治療 Wang等[18]研究報(bào)道胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞(embryonic stem cell-mesenchymal stem cell，ESC-MSCs)來(lái)源的外泌體可以通過(guò)平衡軟骨ECM的合成和降解來(lái)緩解骨關(guān)節(jié)炎。研究團(tuán)隊(duì)在C57BL/6J小鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板去穩(wěn)定化(destabilization of the medial meniscus，DMM)及剪斷內(nèi)側(cè)副韌帶手術(shù)，建立OA模型。4周后于OA模型小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射ESC-MSCs或其外泌體。8周后用組織學(xué)染色和國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)(osteoarthritis research society international，OARSI)評(píng)分評(píng)估軟骨破壞和基質(zhì)降解的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ESC-MSCs組減輕了模型小鼠軟骨破壞和基質(zhì)降解的程度，而注射外泌體組更大程度提高了Ⅱ型膠原酶(Col Ⅱ)和降低了基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)13的表達(dá)。此研究表明ESC-MSCs來(lái)源的外泌體通過(guò)平衡軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，對(duì)OA產(chǎn)生了良好的治療作用，從而為OA的治療藥物及給藥系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Tao等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p過(guò)表達(dá)的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovium-derived mesenchymal stem cell，SMSC)來(lái)源的外泌體(SMSC-140-Exo)可增強(qiáng)軟骨組織再生。他們用含或不含miR-140-5p轉(zhuǎn)染SMSC，分離并鑒定由SMSC或SMSC-140s(SMSC-Exos或SMSC-140-Exos)衍生的外泌體。通過(guò)切斷內(nèi)側(cè)副韌帶和內(nèi)側(cè)半月板的方法建立SD大鼠OA模型，隨機(jī)分為四組，術(shù)后第5～8周每周1次進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射。正常組(未手術(shù)組)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水，接受手術(shù)的OA組大鼠分別注射生理鹽水、OA+SMSC-Exos及OA+SMSC-140-Exos組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射SMSC-140-Exos。手術(shù)12周后收集膝關(guān)節(jié)標(biāo)本評(píng)估疾病的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SMSC-140-Exos在預(yù)防OA方面具有良好的效果和巨大的應(yīng)用潛力。

Cosenza等[20]在Ⅱ型膠原酶誘導(dǎo)的OA(collagenase-induced OA，CIOA)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)、BMSC來(lái)源的細(xì)胞囊泡及BMSC來(lái)源的外泌體均降低了關(guān)節(jié)軟骨的損傷，對(duì)軟骨起到了保護(hù)作用。Zhu等[21]比較了關(guān)節(jié)腔注射滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(SMSC-Exos)及誘導(dǎo)型間充質(zhì)干細(xì)胞(induced mesenchymal stem cell，iMSC)來(lái)源的外泌體(iMSC-Exos)對(duì)C57B/L10小鼠CIOA模型的作用，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有更好的治療效果。越來(lái)越多的研究表明，外泌體在介導(dǎo)組織修復(fù)中起著主導(dǎo)作用。

最近，Lopez-Verrilli等[22]的研究報(bào)道，經(jīng)血來(lái)源的外泌體和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)來(lái)源的外泌體作用相似，均能促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，但經(jīng)血來(lái)源的外泌體促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)作用優(yōu)于BMSC來(lái)源的外泌體的作用。但不同組織來(lái)源的外泌體對(duì)OA的作用是否存在差異，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。目前的研究均顯示MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)OA具有良好的治療作用。MSCs外泌體為開(kāi)發(fā)用于治療軟骨損傷和OA的即用型和無(wú)細(xì)胞療法提供了新的視角。

4 MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)OA的治療機(jī)制

關(guān)節(jié)軟骨損傷以后，包括白介素(interleuki，IL)-1β、IL-6和IL-8在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子和MMP-3快速上調(diào)，并導(dǎo)致了隨后的軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)損傷[23]。這些促炎細(xì)胞因子和MMPs主要由滑膜和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，并促進(jìn)了OA的發(fā)生和發(fā)展[24]。MSCs外泌體蛋白質(zhì)組具有200多個(gè)免疫調(diào)節(jié)蛋白，是多因子協(xié)同作用的理想載體[9]。在IL-1β處理的原代軟骨細(xì)胞中，加入ESC-MSCs外泌體，細(xì)胞免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ColⅡ表達(dá)量顯著升高而聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)5表達(dá)量顯著降低。體內(nèi)結(jié)果同樣表明，MSCs外泌體促進(jìn)了軟骨ECM的合成，抑制了其分解代謝[18]。SMSC和iMSC來(lái)源的外泌體均促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，而后者具有更強(qiáng)的作用[21]。脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在OA患者成骨細(xì)胞中，通過(guò)降低炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的抗衰老作用[25]。

以往的研究表明，microRNA(miRNA)在OA的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。MSCs外泌體攜帶有大量的miRNAs，有研究表明這些miRNA參與疾病相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是MSCs外泌體應(yīng)對(duì)組織損傷和修復(fù)的有效調(diào)節(jié)因子[26]。例如，miR-92a通過(guò)靶向調(diào)節(jié)noggin蛋白經(jīng)PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和ECM合成，從而緩解OA癥狀[27-28]。Matsukawa等[29]報(bào)道，miR-125b在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞ADAMTS-4的表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用。Meng等[30]研究表明miR-320通過(guò)直接作用于靶基因MMP-13來(lái)調(diào)節(jié)軟骨的形成。

此外，也有研究報(bào)道外泌體內(nèi)的蛋白成分也發(fā)揮了積極作用，已被識(shí)別的外泌體蛋白包括：4次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、脂質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂酶以及與外泌體來(lái)源相關(guān)的細(xì)胞特異性蛋白。這些蛋白在幫助外泌體進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)因?yàn)檫@些蛋白的保守性也被用來(lái)當(dāng)作表面標(biāo)記物來(lái)鑒定體外分離得到的外泌體[31]。更多的研究將進(jìn)一步深入揭示MSCs外泌體在不同的條件下組成成分的變化及其對(duì)OA的治療作用機(jī)制。

5 MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)OA治療的應(yīng)用前景

MSCs來(lái)源的外泌體對(duì)OA的治療在臨床上還很少見(jiàn)，還存在一些問(wèn)題需要解決。在臨床研究中，應(yīng)進(jìn)一步探索MSCs來(lái)源的外泌體在體外培養(yǎng)的最佳條件和體內(nèi)治療的確切機(jī)制。不過(guò)，由于外泌體具有獨(dú)特的優(yōu)越性，使其在對(duì)疾病治療中表現(xiàn)了強(qiáng)大的潛在優(yōu)勢(shì)。由于外泌體的形成要在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)多次的包裝，因此外泌體具有生理生化穩(wěn)定性，而MSCs來(lái)源的外泌體可做為一種再生藥物用于疾病的治療。外泌體具有特定的結(jié)構(gòu)和大小，有著特定的分子標(biāo)記，在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)選擇細(xì)胞來(lái)源和改變培養(yǎng)條件很容易獲得特定的外泌體。另外由于外泌體與靶細(xì)胞獨(dú)特的親和性，使得外泌體成為裝載和運(yùn)輸特定蛋白、miRNAs等的理想工具。隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入，外泌體對(duì)骨科疾病的治療已經(jīng)引起了越來(lái)越多學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前已有許多研究報(bào)道MSCs來(lái)源的外泌體可以修復(fù)受損的組織或細(xì)胞，并且MSCs來(lái)源的外泌體表現(xiàn)出對(duì)OA的治療作用。在動(dòng)物模型研究中將進(jìn)一步探索和驗(yàn)證MSCs來(lái)源的外泌體的治療功效、生物安全性、動(dòng)力學(xué)和生物分布等問(wèn)題。另外，外泌體的規(guī)范化抽提，使用外泌體治療的規(guī)范化用量及療程等問(wèn)題，都有待于長(zhǎng)期的、大量的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。這些問(wèn)題的解決將推動(dòng)MSCs來(lái)源的外泌體應(yīng)用于臨床治療。如果外泌體可以用特定的生物制劑和某些產(chǎn)品進(jìn)行包裝生產(chǎn)，那么它們將可以大規(guī)模應(yīng)用于臨床。未來(lái)，MSCs外泌體相關(guān)療法將可能成為臨床上治療OA的常規(guī)再生藥物。

6 結(jié) 論

總之，MSCs外泌體是目前廣為接受的治療疾病的再生藥物，足以介導(dǎo)MSCs對(duì)疾病的治療功效。通過(guò)選擇細(xì)胞的來(lái)源或通過(guò)基因工程操作可以將需要的外泌體進(jìn)行體外擴(kuò)大再生產(chǎn)，從而大規(guī)模應(yīng)用于臨床。在治療OA方面，MSCs外泌體可能是比MSCs細(xì)胞療法更安全、更方便和更有效的治療方式。

目前，外泌體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究才剛剛起步，許多功能及其作用機(jī)制尚未完全闡明，尤其外泌體在骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用研究還相對(duì)較少。隨著外泌體在組織修復(fù)與再生、疾病診斷、靶向藥物治療、免疫治療等方面研究的不斷深入及研究手段的不斷更新，相信MSCs外泌體對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療將會(huì)取得更滿意的效果，得到更廣泛的應(yīng)用。