慢性乙型肝炎治愈新藥研究進(jìn)展*

張 茜，胡 鵬

據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約有2.4億慢性HBV感染者，每年約有65萬人死于慢性HBV感染導(dǎo)致的肝硬化或肝癌[1]。2017年歐洲肝病研究學(xué)會(huì)對(duì)乙型肝炎治愈作出定義：（1）完全治愈（complete sterilizing cure），即血清HBsAg完全檢測(cè)不到，HBV DNA徹底清除，包括共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）和整合的HBV DNA；（2）功能性治愈（functional cure），即在有限的治療療程結(jié)束后血清HBsAg和HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到，伴或不伴HB－sAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，殘留的肝損傷恢復(fù)，遠(yuǎn)期發(fā)生肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的風(fēng)險(xiǎn)降低；（3）部分治愈（partial cure），即在有限的治療療程結(jié)束后血清仍能檢測(cè)到HBsAg陽性，但持續(xù)檢測(cè)不到 HBV DNA[2，3]。

治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物主要分為兩類：（1）核苷（酸）類似物（nucleos（t）ide analogues，NAs]和（2）干擾素類（IFNs）[4，5]。失代償期肝硬化、肝衰竭、合并重要臟器功能障礙、自身免疫性疾病和心理疾病等患者禁用干擾素。在過去十年里，國內(nèi)外學(xué)者為了追求更多的患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈，對(duì)NAs和IFNs聯(lián)合、序貫、聯(lián)合/序貫治療進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)治療 48周 HBsAg清除率為 14.4%，96周為20.7%[7]。新型的抗病毒藥物主要分為兩大類：①作用于乙型肝炎病毒生活周期各靶點(diǎn)的直接抗病毒藥物；②免疫調(diào)節(jié)劑：主要是免疫激活劑，能改善固有免疫和適應(yīng)性免疫功能，從而清除病毒。

1 直接抗病毒藥物

1.1 HBV進(jìn)入肝細(xì)胞抑制劑 HBV進(jìn)入肝細(xì)胞主要通過黏附于硫酸乙酰肝素蛋白多糖，HBV的前S1肽段與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白鈉-?；悄懰猁}共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）特異性結(jié)合，包膜融合，HBV核衣殼釋放至感染肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，抑制病毒進(jìn)入制劑主要分為四類：中和抗體、吸附抑制劑、NTCP底物和不可逆的NTCP抑制劑[8]。其中NTCP抑制劑Myrcludes B正進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，主要觀察該藥物聯(lián)合或不聯(lián)合Peg-IFN在乙型肝炎合并丁型肝炎共感染患者治療48周的抗病毒療效。研究結(jié)果顯示在30例聯(lián)合治療患者中有29例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中15例檢測(cè)不到病毒RNA，而在單藥治療的30例患者中僅有15例HDV RNA下降大于2 lg copies/ml，其中4例檢測(cè)不到病毒核酸。該藥對(duì)于HBsAg的下降沒有明顯影響，主要抑制HBV cccDNA在非感染的肝細(xì)胞中的合成，因此可能在預(yù)防母嬰垂直傳播或肝移植患者再感染方面更有意義[9]。

1.2 靶向作用于HBV cccDNA 包括破壞和損傷cccDNA和使cccDNA功能性沉默。研究發(fā)現(xiàn)IFN-α、淋巴毒素-b受體激動(dòng)劑和T細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子（即IFN-γ和TNF-α）可以非溶解方式從感染細(xì)胞的細(xì)胞核中特異性地清除cccDNA[10-12]。核胞苷脫氨酶（APOBEC3A或APOBEC3B）被招募到cccDNA，經(jīng)過脫氨基作用增加cccDNA分子敏感性并使其降解。另外，分子剪刀，如鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）或者近年來發(fā)現(xiàn)的基于CRISPR/Cas9的基因編輯法似乎在直接靶向并減少cccDNA病毒庫方面都是潛在的工具[13，14]。在今后的試驗(yàn)中，需要進(jìn)一步檢測(cè)脫靶效應(yīng)和細(xì)胞毒性等。在功能性沉默方面，基因組表觀遺傳修飾能阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄活性并關(guān)閉病毒蛋白表達(dá)。但這些作用不具有特異性，因而可能對(duì)宿主細(xì)胞造成不良反應(yīng)[15]。HBV X蛋白（HBx）可通過Smc5/6限制因子降解和抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[16]?；谝陨献饔脵C(jī)制的藥物也在臨床前研究階段。

1.3 靶向作用于病毒轉(zhuǎn)錄本 在動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)，已廣泛開展RNA干擾技術(shù)抑制HBV復(fù)制研究。目前有 ARB-1467、ARB-1740、RG-6004、AROHBV和ARC-520等多種小干擾RNA（siRNA）處于臨床前或早期臨床研究中。ARB-1467是一種新型RNA干擾藥物，通過專有的脂質(zhì)納米粒子（LNP）技術(shù)實(shí)現(xiàn)干擾。在ARB-1467與NAs聯(lián)合治療的IIa期臨床試驗(yàn)中，患者對(duì)該藥物耐受性良好，并使所有受試者血清HBsAg水平降低。在11例HBeAg陰性患者（HBsAg≤1000 IU/ml），給予每兩周靜脈給藥一次，有7例（64%）在治療10周HBsAg降低≥1 lg u/L[17]。箭頭公司研制的ARC-520能沉默cccDNA表達(dá)，Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該藥在患者體內(nèi)能安全耐受，在HBeAg陽性初治患者采用ARC-520治療后HBsAg、HBeAg和HBcrAg明顯，在HBeAg陰性組和HBeAg陰性NAs經(jīng)治患者組HBsAg下降幅度稍低[18]。ARO-HBV主要作用于2.1 kb的S段和0.7 kb X段，能夠減少所有HBV mRNA和整合的HBV DNA的產(chǎn)生，納入HBeAg陽性患者11例和HBeAg陰性患者13例，每月給予ARO-HBV siRNA 1次，共給藥3次，在給藥后1 d發(fā)現(xiàn)HBeAg陽性患者HBsAg水平下降2.1 lg copies/ml，HBeAg陰性患者 HBsAg水平下降 1.8 lg copies/ml，而HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg均有不同程度的下降[19]。該技術(shù)有可能發(fā)生脫靶、載體帶來的毒性反應(yīng)和模式識(shí)別受體引起的免疫激活效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn),需要在今后的實(shí)驗(yàn)中探索解決。

1.4 靶向作用于核衣殼的組裝和前基因組RNA的包裝 核衣殼的形成和前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA）的包裝是病毒生活周期中的關(guān)鍵步驟。因此，針對(duì)該階段進(jìn)行抑制或調(diào)節(jié)在乙型肝炎治愈方面起著重要作用。HBV核心蛋白不僅涉及病毒基因組的轉(zhuǎn)運(yùn)、pgRNA包裝和衣殼的組裝等，還涉及cccDNA染色質(zhì)和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)、病毒RNA的輸出和固有免疫的調(diào)節(jié)。目前，已有幾種非核苷小分子核心蛋白組裝抑制劑，主要通過加強(qiáng)蛋白與蛋白之前的相互作用，抑制pgRNA衣殼化[3]。JNJ-6379是美國楊森公司開發(fā)的衣殼組裝調(diào)節(jié)劑，正處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)分為安慰劑、25 mg、75 mg、150 mg和250 mg五組，每日口服給藥一次，共給藥28 d。在75 mg和150 mg組，38%患者HBV DNA低于檢測(cè)下線；在250 mg組，56%患者HBV DNA低于檢測(cè)下線。隨著劑量增加，患者對(duì)該藥的耐受性依然良好，抗病毒效果強(qiáng)，在大劑量下可能會(huì)破壞衣殼的形成，從而阻礙cccDNA的補(bǔ)充[20]。另一種衣殼抑制劑ABI-H0731在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中納入了HBeAg陽性和陰性非肝硬化患者，其中亞洲人群大于90%，口服給藥每日一次，連續(xù)給藥28 d。檢測(cè)HBV DNA水平較基線下降4.1 lg copies/ml，但該藥對(duì)于HBeAg和HBsAg水平?jīng)]有影響。停藥后出現(xiàn)了病毒學(xué)反彈，但沒有出現(xiàn)生化指標(biāo)的改變[21]。另外，尚處于Ⅰb期臨床研究的藥物NVR3-778顯示出較好的抗病毒活性，患者血清HBV DNA、HBV RNA和HBsAg水平均有所下降，與Peg-IFN聯(lián)合效果更佳[22]。AB-423臨床前研究顯示對(duì)于感染動(dòng)物模型有強(qiáng)效抗病毒活性，聯(lián)合恩替卡韋能增強(qiáng)抗病毒活性，后續(xù)的臨床研究正在進(jìn)行中[23]。

1.5 靶向作用于HBsAg 核酸聚合物可以減少HBsAg的分泌，使外周血HBsAg水平降低，從而極大的促進(jìn)宿主免疫功能的恢復(fù)，達(dá)到清除病毒的目的。臨床試驗(yàn)納入REP2055單藥治療患者8例，REP2139單藥治療患者12例，另外9例短期聯(lián)合Peg-IFN或胸腺肽α-1治療，結(jié)果顯示單藥治療的兩組患者血清HBsAg下降2～7 lg u/L，HBV DNA下降3～9 lg copies/ml，并且出現(xiàn)了HBsAb（10～1712 mIU/ml），短期聯(lián)合治療組有8例出現(xiàn)了HB-sAg消失，9例患者 HBsAb滴度均持續(xù)升高[24]。REP2139聯(lián)合Peg-IFN治療乙型肝炎、丁型肝炎共感染的臨床試驗(yàn)納入12例患者，患者每周接受一次REP 2139 500 mg靜脈注射，持續(xù)15周。然后，每周一次REP 2139 250 mg靜脈注射、Peg-IFNα-2a 180 μg皮下注射，聯(lián)合治療15周，接著用Peg-IFNα-2a 180μg每周一次單藥治療，持續(xù)33周。6例患者在治療結(jié)束時(shí)HBsAg水平低于50 IU/mL（均＜0.05 IU/ml），其中 5例在隨訪 1年結(jié)束時(shí)保持了這種抑制狀態(tài)。6例患者在治療結(jié)束時(shí)HB-sAb滴度超過10 mIU/ml，并有5例患者保持到隨訪1年后。9例患者在治療結(jié)束時(shí)抑制了HBV DNA（＜10 IU/ml），7例患者維持到隨訪結(jié)束時(shí)。11例患者在治療期間HDV RNA轉(zhuǎn)陰，治療結(jié)束時(shí)仍有9例患者HDV RNA陰性，其中7例患者在1年隨訪結(jié)束時(shí)仍為陰性。到1年隨訪結(jié)束時(shí)，在12例患者中有9例發(fā)生血清氨基轉(zhuǎn)移酶正?；痆25]。

1.6 HBV DNA聚合酶 新一代的NAs增強(qiáng)了抗病毒功效，但其口服生物利用度和長期抗病毒耐受性等問題，除了替諾福韋艾拉酚胺已經(jīng)上市外，CMX157、AGX-1009、Besifovir和 Lagociclovir valactate還處于臨床試驗(yàn)階段[26]。此外。去年吉利德公司與Precision合作，利用能夠精確識(shí)別DNA長序列的歸巢核酸內(nèi)切酶靶向作用于DNA序列，實(shí)現(xiàn)基因編輯效率的最大化和脫靶效應(yīng)的最小化，該酶將是治愈HBV感染的另一候選分子。

2 免疫調(diào)節(jié)劑

2.1 治療性疫苗 治療性疫苗旨在誘導(dǎo)功能上有效的抗病毒免疫反應(yīng)，克服已經(jīng)建立的HBV特異性T細(xì)胞的耗竭。目前的治療性疫苗主要包括伴或不伴有強(qiáng)效佐劑的常規(guī)HBsAg疫苗、T細(xì)胞疫苗、HB-sAg和人類抗HBs免疫復(fù)合物、表達(dá)HBV抗原凋亡細(xì)胞、DNA疫苗和表達(dá)HBV蛋白病毒載體的疫苗[3]。酵母來源的HBsAg免疫復(fù)合物（YIC）疫苗已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其在健康人群和慢性乙型肝炎患者使用的安全性在Ⅰ期和Ⅱa期臨床試驗(yàn)中得到了證實(shí)[27]。YIC在雙盲、安慰劑對(duì)照的Ⅱb期試驗(yàn)中顯示出對(duì)慢性乙型肝炎患者的有效性，但是在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中結(jié)果并不理想[28]。在治療組和安慰劑對(duì)照組患者病毒載量和肝功能的恢復(fù)情況結(jié)果相似[29]。另一種疫苗GS-4774是基于熱滅活的酒釀酵母表達(dá)HBsAg、HBcAg和HBxAg。在Ⅱ期臨床試驗(yàn)納入178例NAs經(jīng)治患者，一組繼續(xù)口服抗病毒藥物，一組分別聯(lián)合GS-4774每4周一次，用至20周，在治療24周和48周檢測(cè)HBsAg下降水平無明顯差異，5例HBeAg陽性患者接受GS-4774治療后HBeAg消失，而對(duì)照組無1例出現(xiàn)。3例使用GS-4774患者HBsAg下降大于0.5 lg u/L，沒有出現(xiàn)HBsAg消失[30]。DV-601是一種含有HBsAg和HBcAg的疫苗，其Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示出安全性和免疫原性好，Ⅰb期納入14例慢乙型肝炎患者，采用DV-601聯(lián)合恩替卡韋抗病毒治療，8例中有2例發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，14個(gè)患者中有4例發(fā)生了HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，各組均觀察到HBV DNA下降。在6例HBeAg陽性接受DV-601大劑量治療的患者中有2例檢測(cè)到HBc特異性IFN-γ T細(xì)胞反應(yīng)，但后期臨床試驗(yàn)沒有繼續(xù)開展[31，32]。HeberNasvac是含有HBsAg和HBcAg的疫苗 ，在完成對(duì)慢性乙型肝炎初治患者的Ⅲ期隨機(jī)、開放、Peg-IFN對(duì)照臨床試驗(yàn)中共納入160例慢性乙型肝炎初治患者，與Peg-IFN治療相比，該疫苗更安全、能耐受，表現(xiàn)出持續(xù)病毒學(xué)控制和轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常，在隨訪48周時(shí)HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換率較高[32，33]。

2.2 干擾素類 IFN-α在慢性乙型肝炎的治療中已應(yīng)用于臨床，近年來研究發(fā)現(xiàn)IFN-α能抑制pgRNA衣殼化，增強(qiáng)cccDNA降解，并在cccDNA轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳修飾方面發(fā)揮作用。IFN-α治療HBV不同基因型療效差異巨大，今后有望從該機(jī)制入手尋找新的治療靶點(diǎn)[3]。

2.3 IFN基因激動(dòng)劑的刺激物 IFN基因刺激物是細(xì)胞質(zhì)DNA受體多重銜接蛋白和病原體識(shí)別受體識(shí)別細(xì)菌的第二信使，可能是激活固有免疫反應(yīng)的潛在目標(biāo)。干擾素基因激動(dòng)劑的刺激劑也可以用作治療性疫苗接種的佐劑。維甲酸誘導(dǎo)蛋白1不僅已被證實(shí)能誘導(dǎo)IFN和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)也能通過識(shí)別pgRNA結(jié)構(gòu)，抑制HBV復(fù)制。SB-9200是二核苷酸SB 9000的口服前體藥物，能激活維甲酸誘導(dǎo)蛋白1和核苷酸結(jié)合產(chǎn)生含寡聚化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)2，在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出抗HBV活性，同時(shí)能減少HBsAg的產(chǎn)生[3]。在臨床試驗(yàn)中，對(duì)于HBV DNA和HBV RNA的抑制作用呈劑量依賴性，在HBeAg陰性患者組，給予SB-9200 100 mg治療，血清HBV DNA和HBV RNA下降明顯。在HBeAg陽性患者，血清HBV DNA和HBV RNA下降幅度均較小[34]。

2.4 病原識(shí)別受體 病原識(shí)別受體在固有免疫中發(fā)揮著重要作用。GS-9620是口服的Toll樣受體7（TLR-7）激動(dòng)劑，在慢性乙型肝炎病毒感染的動(dòng)物模型中能較好控制外周血和肝組織HBV DNA復(fù)制，同時(shí)HBsAg也明顯下降[3]，在使用GS-9620與TDF聯(lián)合治療的II期試驗(yàn)中，血清炎性細(xì)胞因子，如IFN-γ誘導(dǎo)蛋白（IP-10）和IFN誘導(dǎo)型T細(xì)胞α化學(xué)引誘物（ITAC），以劑量依賴性方式瞬時(shí)增加。干擾素刺激基因（ISG）mRNA轉(zhuǎn)錄物水平也以類似的劑量依賴性方式被誘導(dǎo)。然而，盡管存在免疫刺激的證據(jù)，但在治療24周后血清HBsAg和HBV DNA沒有顯著下降[35]。

2.5 免疫檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)節(jié) 在慢性HBV感染人群，缺乏T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)部分是由于共抑制受體的過度表達(dá)，其中程序性死亡受體1（PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）和T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）研究較多。Nivolumab是一種針對(duì)PD-1的單克隆抗體，被批準(zhǔn)用于治療實(shí)體器官腫瘤和淋巴瘤。它可能會(huì)逆轉(zhuǎn)慢性乙型肝炎感染的免疫功能障礙，在動(dòng)物模型和人體離體研究的前期試驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)。Ⅰ期臨床試驗(yàn)納入NAs經(jīng)治HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者，靜脈給予nivolumab聯(lián)合或不聯(lián)合GS-4774，均可產(chǎn)生血清HBsAg的適度降低，并且耐受性良好[36]。但需警惕這種方法可能會(huì)產(chǎn)生不受控制的暴發(fā)性肝炎和自身免疫性疾病，導(dǎo)致致命性的器官損傷[3]。另一種凋亡誘導(dǎo)劑APG-1387是凋亡蛋白拮抗劑的二價(jià)小分子抑制劑，目前正在進(jìn)行I期開發(fā)[37]。

慢性HBV感染存在選擇性免疫功能障礙，主要表現(xiàn)為缺乏成熟的記憶T細(xì)胞，HBV特異性T細(xì)胞的耗竭，T細(xì)胞擴(kuò)增受損，細(xì)胞因子產(chǎn)生改變。此外，高病毒載量，持續(xù)暴露于大量的HBV抗原中可進(jìn)一步使HBV特異性T細(xì)胞功能損傷[31]。要想獲得乙型肝炎治愈也許單一用藥難以實(shí)現(xiàn)，采取聯(lián)合治療的策略更可取。一方面要控制病毒載量，減少病毒復(fù)制引起的再感染，改善固有免疫功能；降低病毒抗原滴度，糾正免疫耐受；盡可能減少病毒復(fù)制模版cccDNA水平；另一方面，要恢復(fù)HBV特異性T細(xì)胞的反應(yīng)性，增強(qiáng)體液和固有免疫反應(yīng)，糾正免疫損傷，實(shí)現(xiàn)停藥后的持久免疫應(yīng)答。不同靶點(diǎn)的聯(lián)合治療可以提高耐藥屏障，減少單藥有效劑量，從而減輕藥物不良反應(yīng)?？共《局委熉?lián)合免疫調(diào)節(jié)劑可能是未來治愈慢性乙型肝炎的主流路線。