鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

鄔玉芹，馮智才，陳建強(qiáng)

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院放射科，?？?570208； 2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院燒傷整形外科，長沙 410013)

目前腫瘤的主要治療方式是手術(shù)、放療及化療的綜合治療[1]，雖然在一定程度上可以緩解患者疼痛并使腫瘤體積縮小，但是它們并沒有提高晚期及轉(zhuǎn)移患者的壽命以及改善預(yù)后。放療和化療不僅會造成正常組織損害，而且能降低患者免疫力，從而導(dǎo)致患者對真菌、細(xì)菌及病毒的易感性增加和其生活質(zhì)量下降[2]。正是由于這些不足的存在，癌癥研究人員近十幾年來研發(fā)出了一種新型癌癥治療法即細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤療法，用來解決目前臨床上存在的問題。其具有高度特異性及靶向性，且對患者正常組織不具有損傷性。

細(xì)菌免疫療法是利用體外注射工程化細(xì)菌或者細(xì)菌作為載體表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，特異性并靶向性地消除特定的實(shí)體瘤及其轉(zhuǎn)移病變，同時保留正常組織，從而達(dá)到治愈的目的。細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤療法可為大多數(shù)實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移患者提供可持續(xù)的治療方法，并正朝著可行的解決方案邁進(jìn)。其已在各種臨床前腫瘤模型獲得了有希望的結(jié)果。最近FDA批準(zhǔn)了DC疫苗Sipleucel-T[3]和免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)治療藥CTLA-4單抗Ipilumimab[4]，分別用于前列腺癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，與傳統(tǒng)治療方法相比，它們?nèi)〉幂^好的效果且不良反應(yīng)降低。但就目前的形式而言，細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤免疫療法必須克服免疫耐受、腫瘤微環(huán)境的免疫抑制以及對非靶向組織的嚴(yán)重自身免疫反應(yīng)等障礙。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica serovar typhimurium，ST)能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫力從而具有抗腫瘤性，本文就細(xì)菌免疫治療現(xiàn)狀、鼠傷寒沙門氏菌的生物學(xué)特征及其在臨床中的應(yīng)用研究進(jìn)展作一綜述，探討鼠傷寒沙門氏菌免疫療法治療腫瘤的優(yōu)勢與機(jī)制，以及對未來的展望。

1 細(xì)菌免疫治療現(xiàn)狀

當(dāng)代醫(yī)學(xué)關(guān)于細(xì)菌免疫治療實(shí)體瘤及晚期轉(zhuǎn)移患者的研究比較少，不過近十幾年在這方面的研究開始逐漸增多。目前細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療已在各種臨床前腫瘤模型取得了較好的結(jié)果，其是現(xiàn)代腫瘤治療的新型治療策略。1868年，德國醫(yī)生WILHELM BUSCH首次用細(xì)菌治療癌癥患者。WILLIAM COLEY將由滅活的膿性鏈球菌和粘質(zhì)沙雷氏菌組成的Coley’s毒素，用于腎癌，卵巢癌和肺癌等患者身上，取得了較好的療效[5]。但基于當(dāng)時缺乏對細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療的深入認(rèn)知且隨著放、化療的出現(xiàn)，導(dǎo)致細(xì)菌在臨床使用中不受重視。值得慶幸地是，減毒牛分枝桿菌(BCG)一直在臨床上用作膀胱癌的免疫療法并取得了較好的臨床效益[6]。細(xì)菌激發(fā)人體先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗原呈遞細(xì)胞的激活及免疫細(xì)胞幕集并進(jìn)一步分泌促炎因子如TNF-α、IL-1β[7]，且細(xì)菌對實(shí)體瘤的壞死區(qū)有定植作用，這些抗微生物反應(yīng)集中于腫瘤，從而具有抗腫瘤作用[8]。這正是細(xì)菌免疫治療的優(yōu)勢，其解決了化療和放射對腫瘤的不完全滲透和對健康組織的非特異性損傷[9]。當(dāng)前，能通過基因工程定制定細(xì)菌菌株并且已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的重組細(xì)菌，用于持久激活腫瘤特異性CTL，解決了細(xì)菌誘導(dǎo)的急性炎癥短暫性的缺點(diǎn)。目前運(yùn)用最多的細(xì)菌是單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Lm)和鼠傷寒沙門氏菌及大腸桿菌，他們對實(shí)體瘤的壞死區(qū)具有較好的定位及特異性，從而使它們成為當(dāng)前細(xì)菌免疫治療研究的焦點(diǎn)，并且在腫瘤動物模型中取得了一定的成果。如減毒鼠傷寒沙門氏菌已證明在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型有效。但是細(xì)菌免疫治療也有不足之處，其不能定向定植和消除實(shí)體瘤的可存活區(qū)域。

2 鼠傷寒沙門氏菌的生物學(xué)特征

鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)入宿主后首先侵入人體腸黏膜并分泌內(nèi)毒素，如脂溶素(LPS)，其是TLR4通路的天然配體[10]，利用此通路感染宿主細(xì)胞，并最終被吞噬細(xì)胞捕獲。目前已有研究[11]表明，減毒鼠傷寒沙門氏菌對多種惡性實(shí)體瘤具有高度靶向性，利用獨(dú)立的減毒鼠傷寒沙門氏菌或用其作為基因載體可以治療多種惡性實(shí)體瘤。對于治療前出現(xiàn)過鼠傷寒沙門氏菌感染的患者，細(xì)菌載體對腫瘤免疫治療的療效會受到其影響[12]。無須擔(dān)心的是，其可以通過反復(fù)加強(qiáng)來減輕先前存在的免疫對細(xì)菌遞送抗原反應(yīng)的影響并將其降低到最小[13]。在淋巴器官中，巨噬細(xì)胞吞噬鼠傷寒沙門氏菌而感染，其在巨噬細(xì)胞吞噬體中被保持隔離并慢慢生長及復(fù)制[14]。單核增生細(xì)胞李斯特菌同樣能夠逃逸吞噬體到胞質(zhì)溶膠中，與鼠傷寒沙門氏菌的區(qū)別在于，其不是在空泡中復(fù)制及生存，而是在胞質(zhì)溶膠中迅速分裂并高效地將抗原遞送到免疫細(xì)胞[15]。有研究[16]表明，對于表達(dá)相同抗原，單核增生細(xì)胞李斯特菌比鼠傷寒沙門氏菌載體呈遞抗原作用更強(qiáng)，并且引起更強(qiáng)大的免疫應(yīng)答及抗腫瘤效果。有趣的是，TAKAHASHI等[17]通過使用Ⅲ型分泌系統(tǒng)改善沙門氏菌來增強(qiáng)其抗原呈遞作用及抗腫瘤效力。目前沙門氏菌的疫苗在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)得到了證實(shí)[18]。但在這之前關(guān)鍵是需要了解它們的細(xì)胞定位及誘導(dǎo)免疫的機(jī)制。鼠傷寒沙門氏菌分泌內(nèi)毒素即脂溶素，其與Toll樣受體即TLR4受體結(jié)合，識別細(xì)菌病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，引起一系列的生物學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)大量促炎細(xì)胞因子釋放，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β等，導(dǎo)致針對病原體和腫瘤的有效細(xì)胞免疫應(yīng)答。但是在引起有效的免疫應(yīng)答之前，鼠傷寒沙門氏菌必須逃逸吞噬細(xì)胞的殺傷。為了躲避吞噬體，宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌分泌多種毒力因子，如防御素、活性氧和氮中間體，吞噬溶酶體微生物機(jī)制及微環(huán)境的pH值恰好能被這些微小因子改變，進(jìn)一步導(dǎo)致溶酶體活性的改變。其就是利用抑制吞噬體-溶酶體融合來防止吞噬體的酸化，從而構(gòu)建一個無害的液泡，細(xì)菌可在其中生存和分裂增殖。某些研究者已經(jīng)利用鼠傷寒沙門氏菌這一特性，在phoP基因座中編碼毒力因子誘導(dǎo)形成較多空泡，細(xì)菌在這些空泡中能夠長久存在和持續(xù)生長[19]。

3 鼠傷寒沙門氏菌可用于目標(biāo)腫瘤的免疫治療

總所周知，惡性實(shí)體瘤存在異常血管、缺氧、壞死區(qū)域這三大特點(diǎn)[20]。惡性實(shí)體瘤這三大特征恰好能吸引厭氧性或兼性厭氧細(xì)菌，例如雙歧桿菌[21]、沙門氏菌[22]、埃希氏菌[23]、梭菌[24]和李斯特菌[25]。從而導(dǎo)致腫瘤組織中細(xì)菌大量集聚及增殖，甚至比其他器官如肝臟和脾臟中的細(xì)菌數(shù)量高出一千倍以上[26]。另一原因?qū)е录?xì)菌優(yōu)先靶向腫瘤內(nèi)部是腫瘤微環(huán)境存在免疫抑制性，細(xì)菌能夠逃避免疫系統(tǒng)攻擊。有研究[27]表明鼠傷寒沙門氏菌在結(jié)腸癌模型中顯示出較高的定植率，而且抑癌作用較明顯。首先，鼠傷寒沙門氏菌是兼性厭氧菌，其除了可以靶向惡性腫瘤缺氧壞死區(qū)外，還能夠定植血液較豐富的腫瘤活體部分[28]。其次，ST在腫瘤組織內(nèi)濃度滴度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常組織。另外，已有研究[29]表明可以通過體外敲除鼠傷寒沙門氏菌合成某些核酸或氨基酸的基因而使其毒力減弱或者利用其作基因載體產(chǎn)生針對惡性實(shí)體瘤微環(huán)境的菌株。最新研究[30]表明，幾種減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株抑制腫瘤生長，目前在臨床上，VNP20009屬于鼠傷寒沙門氏減毒菌株，其purI和msbB基因被敲除，應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性黑素瘤和腎細(xì)胞癌的患者并取得較好的效果。在黑素瘤或者結(jié)腸癌小鼠模型中，給小鼠腹腔或者皮下注射ST各種減毒營養(yǎng)缺陷型菌株，觀察腫瘤組織細(xì)菌集聚明顯多于其他組織；而另一種A1-R減毒菌株既能抑制各種小鼠實(shí)體瘤模型中腫瘤的生長甚至消退，又能增加腫瘤組織對化學(xué)療法的敏感性[31-32]。

4 鼠傷寒沙門氏菌在臨床治療中的應(yīng)用

目前已證實(shí)了減毒ST菌株在各種小鼠模型中能抑制原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤生長，但它在臨床上運(yùn)用的效果非常有限。20世紀(jì)初，VNP20009被運(yùn)用于黑色素瘤患者，只是在少數(shù)轉(zhuǎn)移患者中觀察到了少量細(xì)菌定植，完全沒有觀察到抗腫瘤效果[33]，這可能是由于VNP20009在血液里被清除較快引起。其與皮下種植結(jié)腸癌小鼠模型中觀察的結(jié)果完全相反，如靜脈注射不久后即可在腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)ST高濃度定植和腫瘤微環(huán)境分泌大量促炎細(xì)胞因子。另外部分原因可能是人體表達(dá)Nramp1蛋白，而小鼠不表達(dá)，從而使小鼠更易受ST感染。Nramp1是一種重要的細(xì)菌抗性蛋白，在吞噬溶酶體膜中表達(dá)，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中鐵的水平。由于在使用VNP20009作為單一療法的臨床試驗(yàn)中觀察到令人失望的結(jié)果，故在2017年，有研究者[34]利用Nivolumab與Ipilimumab聯(lián)合治療黑色素瘤并觀察到較好的療效，證實(shí)了聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥有更好的療效。沙門氏菌具有特殊的機(jī)制，允許進(jìn)入和擴(kuò)散在上皮細(xì)胞和其他非吞噬細(xì)胞內(nèi)。ST編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)通過肌動蛋白的重組，負(fù)責(zé)生產(chǎn)與宿主細(xì)胞膜相互作用的銜接復(fù)合物并促進(jìn)細(xì)菌遞送重要的蛋白質(zhì)。目前，遠(yuǎn)程工程化沙門氏菌TTSS在癌癥和傳染病的獨(dú)特疫苗抗原遞送系統(tǒng)，取得了良好的結(jié)果。這一過程不僅有助于ST在腫瘤微環(huán)境中持續(xù)較長時間，允許細(xì)菌逃避免疫，利于其抗腫瘤功效，同時該系統(tǒng)使ST成為DNA，毒素和其他治療藥物的理想傳遞載體，使分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。

鼠傷寒沙門氏菌可以作為cDNA、mRNA、腫瘤相關(guān)抗原(TAA)及細(xì)胞因子遞送載體并目前已經(jīng)運(yùn)用至各種動物癌癥模型。如表達(dá)IL-2的ST既成功運(yùn)用于黑色素瘤模型，又運(yùn)用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型，并且明顯觀察到對腫瘤的抑制作用。腸炎沙門氏菌血清型鼠傷寒沙門氏菌已用于將腫瘤抗原作為DNA質(zhì)粒和蛋白質(zhì)遞送至免疫系統(tǒng)。由于沙門氏菌是革蘭氏陰性的，因此可以構(gòu)建高度減毒的菌株以降低與LPS相關(guān)的毒性[35]。此外，ST可以被修飾用于腫瘤特異性前藥轉(zhuǎn)化，TAPET-CD重組ST在小鼠結(jié)腸癌模型中取得了成功[36]?？傊?，這些研究為減毒ST的替代使用提供了強(qiáng)有力的支持，其可嚴(yán)格地作為腫瘤免疫治療的菌株。

目前正在大力探索鼠傷寒沙門氏菌作為治療性抗腫瘤的潛力。ST具有將治療方式傳遞到腫瘤內(nèi)部的能力且ST可高度操作，具有任意組合治療方案。其可能會成功地治療侵略性和轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤，給晚期惡性腫瘤患者的治療帶來希望。