let-7d抑制劑對海馬神經元離體氧糖剝奪/復氧細胞損傷的凋亡抑制作用

李中巖,李文媛,王 瑩,李雪花

(1阜新市中心醫(yī)院神經外科,阜新 123000;2牡丹江醫(yī)學院神經組織工程研究所;3阜新市中心醫(yī)院神經內科;*通訊作者,E-mail:yingwang770224@163.com)

腦缺血/再灌注損傷是一種常見臨床疾病,在世界范圍內導致高致殘率和死亡率。腦缺血/再灌注損傷引起腦損傷能夠造成多種神經系統(tǒng)后遺癥,包括失語癥、偏癱和癡呆等[1-3]。然而,目前尚缺乏有效的治療手段。腦缺血再灌注損傷病理過程復雜,目前大量研究證實通過神經生長因子(nerve growth factor,NGF)干預腦缺血/再灌注損傷可能是一種有前景的治療方法[4]。NGF是神經營養(yǎng)因子家族中最先發(fā)現(xiàn)的成員,NGF促進神經元發(fā)育和維持細胞表型,保護中樞神經系統(tǒng)膽堿能神經元功能完整性。但目前NGF臨床應用仍然存在一些限制,包括NGF有害副作用和應用復雜性[5]。

miRNAs是一組小的非編碼RNA,以轉錄后方式調節(jié)基因表達。其通過與目的mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)結合,導致mRNA降解或翻譯抑制。miRNAs通過靶向不同的基因及相關的關鍵信號通路,參與多種生理和病理過程[6]。大量研究表明miRNAs參與腦缺血/再灌注損傷的病理過程,并調節(jié)神經元存活和凋亡過程中各種關鍵基因的表達,成為腦缺血/再灌注損傷新的生物標記物和治療靶點[7]。因此探討miRNA分子表達和功能可以有效揭示腦缺血再灌注損傷的分子機制。

let-7d microRNAs(miRNAs)是let-7 miRNA家族成員。let-7 miRNA最初在秀麗隱桿線蟲被發(fā)現(xiàn),其保存在脊椎動物和無脊椎動物中。近來研究發(fā)現(xiàn)let-7d能夠調節(jié)干細胞分化、影響神經變性和神經元再生[8,9],抑制let-7能夠促進大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[10]。前期研究證實,坐骨神經損傷后let-7d通過直接靶向作用NGF,并抑制其蛋白翻譯,顯著降低雪旺細胞(Schwann cells,SCs)增殖和遷移[11],但在腦缺血再灌注損傷中l(wèi)et-7d對海馬神經元的作用及調控機制國內外尚無報道。研究表明細胞調亡在腦缺血再灌注損傷后神經元細胞的損傷和保護中發(fā)揮重要作用,通過氧糖剝奪與復氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)模擬體內的腦缺血再灌注病理生理過程,能夠誘導神經元細胞凋亡[12]。目前OGD/R海馬神經元細胞模型被公認為是最合適的體外模擬腦缺血的模型,常用于從細胞及分子水平研究腦缺血再灌注損傷的機制及藥物治療效果[3,6,7],因此本研究利用OGD/R技術誘導HT22海馬神經元損傷模型,模擬“腦缺血”狀態(tài)。觀察轉染let-7d模擬物和抑制劑對OGD/R細胞活性和細胞凋亡的作用,探討let-7d抑制劑對缺血再灌注損傷海馬神經元的保護作用機制,為臨床腦缺血再灌注損傷治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

小鼠海馬神經元HT22細胞系購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。應用DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)、4.5 g/L葡萄糖和1%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)HT22細胞(均購自美國sigma公司)。

1.2 OGD/R細胞模型制備

將HT22細胞在無糖平衡鹽溶液中培養(yǎng)，在三氣缺氧細胞培養(yǎng)箱(1% O2、94% N2、5% CO2、37 ℃)培養(yǎng)6 h，用含4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基代替無糖平衡鹽溶液，在正常條件下復氧培養(yǎng)48 h制備OGD/R模型[1]。未經OGD/R處理的細胞作為正常組，采用HT22細胞完全培養(yǎng)液、正常細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)進行培養(yǎng)。

1.3 細胞分組

miRNA-NC、let-7d mimics和let-7d inhibitor購自美國abm公司,應用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)按說明書對OGD/R細胞進行轉染,將細胞分為正常組、OGD/R+miRNA-NC組、OGD/R+let-7d mimics組和OGD/R+let-7d inhibitor組。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

應用Trizol(美國Invitrogen公司)提取總RNA,并用逆轉錄試劑盒和逆轉錄酶逆轉錄cDNA,U6作為let-7d內參照,GAPDH作為NGF內參照。反應體系包括10 ml SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)、2 ml引物(中國TaKaRa公司)和8 ml cDNA(德國Qiagen公司)。各引物序列為:let-7d上游5′-TGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTTGAGG-3′,下游5′-GCAAGGCAGTGGCCTGTACAGTTATC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。NGF上游5′-CCAAGGACGCAGCTTTCTATC-3′,下游5′-CTGTGTCAAGGGAATGCTGAAG-3′;GAPDH上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′,下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′。利用2-ΔΔCt方法分析。

1.5 細胞活性檢測

應用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒,采用比色法測定細胞活力,即將各組細胞接種在96孔板中并培養(yǎng)過夜,每孔加入10 ml CCK-8溶液在37 ℃下培養(yǎng)2 h,在450 nm波長應用酶標儀測定吸光度值。

1.6 細胞凋亡檢測

各組細胞接種在6孔板。加入1 ml Hoechst33342孵育0.5 h,應用50 g/L PI孵育15 min,根據(jù)前期研究方法[13]在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)觀察,每組細胞于高倍鏡下隨機選取視野,計算凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)(每組不少于1 000個),計算凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 海馬神經元細胞OGD/R后let-7d表達降低

qRT-PCR結果表明,與正常組比較,let-7d mRNA在海馬神經元細胞OGD/R后6,12,24 h表達顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.001),在OGD/R后48 h,let-7d mRNA表達升高,與正常組無顯著差異(見圖1)。

與正常組比較,*P<0.05,***P<0.001圖1 qRT-PCR檢測海馬神經元細胞OGD/R后let-7d mRNA表達Figure 1 The let-7d mRNA expression in hippocampal neurons after OGD/R by qRT-PCR

2.2 let-7d抑制劑降低OGD/R后海馬神經元細胞let-7d表達,升高NGF表達

與正常組比較,OGD/R+miRNA-NC組let-7d mRNA表達顯著降低。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組let-7d mRNA表達顯著增高,而OGD/R+let-7d inhibitor組顯著降低(F3,12=165.8,P<0.001)。與之相反,OGD/R+miRNA-NC組NGF mRNA表達較正常組顯著升高;與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組NGF mRNA表達顯著降低,而OGD/R+let-7d inhibitor組NGF mRNA表達則顯著升高(F3,12=71.27,P<0.001,見圖2)。

與正常組比較，***P<0.001;與NC組比較，###P<0.001圖2 qRT-PCR檢測各組細胞let-7d和NGF mRNA相對表達Figure 2 The let-7d and NGF mRNA expression in hippocampal neurons in different groups by qRT-PCR

2.3 let-7d抑制劑逆轉OGD/R后海馬神經元細胞活性降低

與正常組比較,OGD/R+miRNA-NC組細胞活性顯著降低。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組細胞活性顯著降低,而OGD/R+let-7d inhibitor組顯著增高(F3,12=160.3,P<0.001,見圖3)。

2.4 let-7d抑制劑降低OGD/R后海馬神經元細胞凋亡率

OGD/R+miRNA-NC組細胞凋亡率較正常組顯著增高。與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組細胞凋亡率顯著增高,而OGD/R+let-7d inhibitor組則顯著降低(F3,12=188.0,P<0.001,見圖4)。

與正常組比較，***P<0.001;與NC組比較，###P<0.001圖3 CCK-8法檢測各組細胞活性 (n=3)Figure 3 Cell viability in different groups by CCK8 assay (n=3)

A.正常組; B.OGD/R+miRNA-NC組; C.OGD/R+let-7d mimics組; D.OGD/R+let-7d inhibitor組圖4 Hoechst33342/PI雙染法檢測各組細胞凋亡Figure 4 Cell apoptosis in different groups by Hoechst33342/PI double staining

3 討論

腦缺血/再灌注損傷是一個普遍存在的全球性臨床問題,嚴重影響患者的生活質量并造成巨大的經濟負擔,臨床治療促進腦缺血/再灌注損傷神經功能恢復效果有限。microRNAs是內源性編碼保守的小RNAs(20-22堿基對),其主要通過促進靶向mRNAs的降解或抑制蛋白質翻譯調節(jié)基因表達。miRNAs在神經發(fā)育、變性和再生中發(fā)揮重要調節(jié)作用[14]。大量證據(jù)表明,miRNAs在腦缺血/再灌注損傷中表達失調,并在調節(jié)神經元存活中發(fā)揮關鍵作用[7,15]。

let-7家族由13個成員組成,這些成員在物種間高度保守。它們共享相同的種子序列并靶向不同細胞類型的多個基因[8]。已知let-7家族的多種基因調控Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1)、Bcl-xl和AGO1等靶基因,在缺血性心臟病中發(fā)揮作用,降低心肌纖維化和心肌細胞凋亡;抑制let-7c可改善心肌梗死后的心臟功能;上調let-7g可通過靶向pik3ip1(急性缺血再灌注損傷時Akt信號通路的抑制劑)保護心肌細胞免受凋亡[16]。上調let-7d可靶向NGF顯著降低施萬細胞(Schwann cells,SCs)的增殖和遷移,抑制坐骨神經功能恢復[11],但let-7d在腦缺血再灌注損傷中的作用尚未見報道。

let-7d是否參與細胞OGD/R損傷國內外尚無報道,在本研究中首先評估let-7d在海馬神經元OGD/R損傷后不同時間點let-7d的表達規(guī)律。結果顯示OGD/R損傷后6,12,24 h,海馬神經元let-7d的表達顯著降低,48 h表達水平上調,與對照組無顯著差異。表明let-7d可能是參與調節(jié)OGD/R誘導的海馬神經元損傷的新型miRNA。前期研究證明,坐骨神經損傷后let-7表達降低,并與NGF表達呈負相關。let-7表達降低能夠顯著促進SCs分泌NGF,促進SCs增殖和遷移,抑制SCs凋亡,對SCs具有顯著保護作用[11]。因此本研究推測OGD/R損傷后let-7d表達降低對海馬神經元細胞損傷具有同樣保護作用,let-7d表達下調可能是OGD/R損傷早期保護性反應,進一步抑制let-7d表達可起到抑制神經元細胞凋亡的作用。為證實這一假說,本研究首先探討OGD/R與海馬神經元細胞凋亡的關系,結果發(fā)現(xiàn),OGD/R組較正常組細胞活性顯著降低,細胞凋亡率顯著增高,再次證實OGD/R能夠誘導神經元細胞凋亡。進一步檢測let-7d模擬物和抑制劑對細胞活力和凋亡的影響。結果表明let-7d抑制劑顯著降低OGD/R誘導的細胞凋亡,同時顯著增加細胞活性。而let-7d模擬物具有相反的效果。這些結果證實抑制let-7d對OGD/R處理的神經元細胞凋亡具有保護作用。

前期研究發(fā)現(xiàn),let-7d miRNA靶向NGF的作用與NGF對中樞神經再生的神經營養(yǎng)作用一致[11]。NGF在神經營養(yǎng)素家族中具有重要地位,其在周圍神經系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)神經元發(fā)育和存活中發(fā)揮關鍵作用[17]。同時NGF能夠參與免疫和炎癥反應[18]。目前重組人神經生長因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF)在臨床上應用最為廣泛,然而rhNGF對人體的副作用不容忽視,包括肌肉疼痛和注射部位痛覺過敏、半衰期短、不能跨越血腦屏障,以及高劑量時可能的致瘤性[5]。因此,通過神經元細胞分泌NGF的內源性調控可作為外源性NGF的治療提供替代方案?；谶@一考慮,本文研究了let-7d對海馬神經元產生NGF的影響,結果表明與OGD/R+miRNA-NC組比較,OGD/R+let-7d mimics組let-7d表達顯著增高,NGF表達顯著降低。而OGD/R+let-7d inhibitor組作用與之相反。再次證實let-7d在OGD/R細胞模型中靶向調控NGF表達。研究證實NGF作為經典內源性保護因子,能顯著抑制細胞凋亡,發(fā)揮神經保護作用[19],因此本研究推測let-7d抑制劑調節(jié)OGD/R損傷機制可能通過調控NGF信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述,本研究探討并證實了體外let-7d抑制劑對海馬神經元缺血/再灌注損傷的保護作用,其機制可能與上調NGF信號通路,抑制細胞凋亡有關。