JMJD1A蛋白在宮頸癌細(xì)胞增殖中的作用

吳曉玲,萬秋園,楊 陽,樊江波

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:fanjiangbo2004@163.com)

宮頸癌(cervical cancer)是婦女最常見的生殖道腫瘤。我國每年新增病例超過13萬,約占全世界總數(shù)的1/4,位居?jì)D女生殖道惡性腫瘤的第一位,嚴(yán)重危害婦女的健康和生命[1]。盡管近年來,隨著宮頸癌的普查、普治工作的開展,宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均明顯下降,但宮頸癌的發(fā)病年齡呈年輕化趨勢,且晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌患者預(yù)后較差。因此對宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究有助于腫瘤的預(yù)防和治療。

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白。組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)的重要研究領(lǐng)域,其在基因調(diào)控中起至關(guān)重要的作用,并與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病有關(guān)[2,3]。組蛋白去甲基化酶JMJD1A(Jumonji domain containing 1A),又叫JHDM2A、KDM3A,屬于JMJD家族,通過羥基化作用使組蛋白賴氨酸去甲基而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),是調(diào)控H3K9表觀遺傳學(xué)修飾的關(guān)鍵調(diào)控因子[4],參與精子生成[5]、能量代謝[6]、干細(xì)胞調(diào)控,與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[7,8],是潛在的抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。然而目前有關(guān)JMJD1A在宮頸癌等女性生殖道腫瘤的研究報(bào)道尚不多,因此,本研究旨在探索JMJD1A在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,期望為宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa、CaSki和C-33A均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)細(xì)胞庫,為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用含100 ml/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Sigma公司),于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究使用。

1.2 組織取材與標(biāo)本處理

48例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織為2017-01～2018-12間在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的宮頸癌住院患者,年齡范圍為32-69歲,中位年齡55歲。腫瘤患者術(shù)前或取材前均未接受放療及化療,早期患者手術(shù)行廣泛全子宮加/不加雙側(cè)附件切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù),術(shù)后進(jìn)一步病理確診,于癌灶中心部位切取小塊組織。晚期患者在同步放化療前活檢獲得癌組織標(biāo)本。33例正常宮頸組織來自于同時(shí)期宮頸HPV及液基細(xì)胞學(xué)檢查均為陰性的子宮肌瘤子宮全切術(shù)患者。

所有標(biāo)本均經(jīng)查閱病例資料并由本院病理醫(yī)師復(fù)閱HE切片證實(shí)。所取組織一部分用新鮮配制40 g/L多聚甲醛(pH 7.4)固定后石蠟包埋處理;另一部分裝入已編號(hào)的滅菌凍存管中,迅速放入液氮轉(zhuǎn)移罐中,再轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱長期保存,隨機(jī)抽取8例正常宮頸組織和20例宮頸癌組織進(jìn)行總蛋白提取待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。以上標(biāo)本的獲取均取得患者知情同意。采集程序均符合醫(yī)學(xué)倫理實(shí)踐的要求。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測JMJD1A蛋白染色情況

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測各組宮頸組織標(biāo)本中JMJD1A的表達(dá),其中33例正常宮頸組織(NC)和48例宮頸癌(CC)臨床標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)固定包埋,連續(xù)切片后,依次經(jīng)脫蠟水化、封閉后,加入一抗(鼠抗人單克隆JMJD1A,1 ∶100,美國Santa Cruz公司)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗37 ℃孵育30 min后,加入顯色劑顯色。磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:JMJD1A免疫染色采用半定量免疫反應(yīng)評分(immunoreactivity score,IRS):按染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色陽性率進(jìn)行分級。取有代表性的5個(gè)高倍視野(×1 000)進(jìn)行計(jì)數(shù)。JMJD1A染色陽性者以細(xì)胞核呈棕黃色或黃色者為準(zhǔn):未著色為0,淡黃色為1,黃色為2,棕黃色為3;陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)<10%為0,10%-25%為1,26%-50%為2,51%-75%為3,>75%為4。每張切片染色強(qiáng)度與染色陽性率相乘結(jié)果為總評分,大于3分為陽性。

1.4 Western blot檢測JMJD1A蛋白表達(dá)情況

隨機(jī)抽取存8例正常宮頸組織和20例宮頸癌組織樣本,并將對數(shù)生長期的各組宮頸癌細(xì)胞提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度。制備凝膠,樣品制備,取等量的蛋白質(zhì)樣品上樣,用10%SDS/PAGE電泳后移至PVDF膜,封閉,抗體孵育,其中一抗為鼠抗人JMJD1A單克隆抗體(1 ∶1 000,Santa Cruz)及鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1 ∶1 000,Santa Cruz),二抗為HRP-羊抗鼠抗體(1 ∶10 000,PIERCE)。以GAPDH為內(nèi)參,ECL化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色,用Image J灰度分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細(xì)胞,接種于12孔板,待細(xì)胞匯合度至70%-90%,依據(jù)Invitrogen公司Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。含JMJD1A的shRNA序列載體購自上海吉瑪基因公司。實(shí)驗(yàn)設(shè)有3個(gè)組:空白對照組(HeLa/SiHa):轉(zhuǎn)染時(shí)只加入無血清DMEM;陰性對照組:加入negative control shRNA(HeLa-Ctrl/SiHa-Ctrl);實(shí)驗(yàn)組:加入JMJD1A特異性shRNA(HeLa-shJMJD1A/SiHa-shJMJD1A)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入適宜的G418篩選陽性克隆細(xì)胞株,經(jīng)Western blot法鑒定。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

采用MTT分析法檢測陰性對照組(HeLa-Ctrl/SiHa-Ctrl)和實(shí)驗(yàn)組(HeLa-shJMJD1A/SiHa-shJMJD1A)的細(xì)胞活力。將上述各組細(xì)胞以8×104/孔細(xì)胞密度種植于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)7 d,每隔一天(即分別于培養(yǎng)的第1,3,5,7天)取出加入MTT溶液(Sigma公司,5 mg/ml)20 μl,繼續(xù)孵育4 h后,棄去上清,加入DMSO 150 μl/孔,震蕩10 min,活細(xì)胞數(shù)量用分光光度計(jì)測定各孔在490 nm的吸光度值,根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線(每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

分別取對數(shù)生長期的陰性對照組(HeLa-Ctrl/SiHa-Ctrl)和實(shí)驗(yàn)組(HeLa-shJMJD1A/SiHa-shJMJD1A)細(xì)胞(1×106個(gè)),在4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠(上海SLAC公司)背部皮下注射接種,每隔3 d觀察記錄一次成瘤情況,共觀察33 d。按公式V=ab2/2(a為長,b為寬)計(jì)算移植瘤體積,繪制生長曲線圖。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,處死裸鼠,完整取出移植瘤并稱重記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 JMJD1A在正常宮頸組織與宮頸癌中的表達(dá)情況

與正常宮頸組織比較,JMJD1A表達(dá)在宮頸癌組織中顯著升高(見圖1A)。免疫組化染色半定量免疫反應(yīng)評分(IRS)示:JMJD1A染色在宮頸癌組織中的表達(dá)評分為7.4,明顯高于正常組織中的2.7(P<0.001,見圖1B)。

圖1 JMJD1A在宮頸癌組織中的表達(dá)情況Figure 1 The expression and IRS of JMJD1A in normal cervix and cervical carcinoma specimen using IHC

2.2 正常宮頸組織及宮頸癌組織中JMJD1A的Western blot檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示,相對于正常宮頸組織,宮頸癌組織中JMJD1A蛋白水平顯著升高,蛋白水平定量分析其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。

圖2 Western blot檢測JMJD1A在正常宮頸和宮頸癌組織中的表達(dá)Figure 2 JMJD1A expression in normal cervix and cervical carcinoma tissues by Western blot

2.3 shRNA干擾對宮頸癌細(xì)胞中JMJD1A表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,JMJD1A蛋白高表達(dá)于各宮頸癌細(xì)胞株中,其中以CaSki細(xì)胞中表達(dá)最高。利用JMJD1A-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定干擾宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa中JMJD1A的表達(dá),結(jié)果顯示,與對照組細(xì)胞(Ctrl)相比,shRNA可顯著降低細(xì)胞中JMJD1A蛋白表達(dá)水平(見圖3)。

圖3 Western blot檢測JMJD1A在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)及干擾效率Figure 3 The expression of JMJD1A in cervical cancer cell lines and interference efficiency by Western blot

2.4 干擾JMJD1A表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞增殖能力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞中,與對照組(Ctrl)相比,隨著時(shí)間延長,干擾JMJD1A表達(dá)后明顯抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長速度及細(xì)胞活性,于培養(yǎng)第5天及第7天時(shí)各干擾組與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖4),說明JMJD1A下調(diào)可以顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的體外增殖能力。在SiHa細(xì)胞中,我們得到與HeLa細(xì)胞相一致的結(jié)果。

A.HeLa細(xì)胞 B.SiHa細(xì)胞與相應(yīng)對照組比較,*P<0.05,***P<0.001圖4 MTT法檢測JMJD1A對宮頸癌細(xì)胞生長的影響Figure 4 Effect of JMJD1A on proliferation of HeLa and SiHa by MTT

2.5 干擾JMJD1A表達(dá)對宮頸癌移植瘤生長的抑制作用

裸鼠移植瘤生長曲線圖顯示,各組種植瘤持續(xù)生長33 d，于第33天時(shí)拍照記錄并處死裸鼠獲取腫瘤。與對照組相比,JMJD1A干擾后HeLa細(xì)胞腫瘤生長曲線緩慢上升,生長速度明顯低于對照組,兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.861,P<0.001,見圖5A)。于第33天獲取移植瘤,與對照組相比,JMJD1A干擾組移植瘤平均質(zhì)量顯著減小[(1.190±0.569)gvs(0.620±0.384)g,P<0.001,見圖6A]。在SiHa細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果,JMJD1A下調(diào)后裸鼠移植瘤生長速度明顯低于對照組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.23,P<0.001,見圖5B),移植瘤質(zhì)量差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖6B)。以上結(jié)果提示JMJD1A下調(diào)后顯著抑制宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)移植瘤的生長。

A.HeLa細(xì)胞腫瘤生長曲線 B.SiHa細(xì)胞腫瘤生長曲線與相應(yīng)對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖5 JMJD1A下調(diào)后顯著抑制宮頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長Figure 5 JMJD1A downregulation significantly suppressed the growth of xenografts in HeLa and SiHa cervical cancer cells in vivo

圖6 JMJD1A下調(diào)對宮頸癌細(xì)胞移植瘤質(zhì)量的影響Figure 6 The effect of JMJD1A downregulation on the xenografts weight in nude mice inoculated with cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]。近年來隨著宮頸癌普查、普治工作的開展,其死亡率均明顯下降。其治療手段主要為手術(shù)聯(lián)合放化療為主,其他治療(熱療、免疫治療等)為輔的綜合治療。而宮頸癌的5年生存率僅為55%左右,術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及放化療耐藥等仍是目前臨床治療的難題。研究證實(shí),宮頸癌的發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染密切相關(guān),但并非所有感染HPV者都會(huì)發(fā)展成為宮頸癌[9]。有關(guān)宮頸癌發(fā)病機(jī)制至今尚不明確,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多因素作用、多階段進(jìn)展的病理過程,涉及癌基因的激活與抑癌基因的異常調(diào)控等[10,11]。

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白。組蛋白甲基化修飾是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過程,甲基化與去甲基化平衡失調(diào)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,其與組蛋白乙?；７Q為“第二套遺傳密碼”,是當(dāng)前遺傳學(xué)和腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[12]。已知組蛋白去甲基化酶包括賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine-specific-demethylase,LSD)家族和含JmjC結(jié)構(gòu)域的JMJD家族[13,14]。JMJD家族成員眾多,且催化底物多樣,它們廣泛參與了發(fā)育學(xué)多個(gè)階段的生物學(xué)作用,其突變或功能異常可造成疾病的發(fā)生[15],其中JMJD1A是研究較為深入的一種。JMJD1A通過降低靶基因啟動(dòng)子H3K9me1/2表達(dá)水平、調(diào)節(jié)染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、影響轉(zhuǎn)錄,從而達(dá)到調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)的目的,參與精子生成、能力代謝等多種生物學(xué)功能。已有研究表明,JMJD1A在多種腫瘤中高表達(dá),發(fā)揮原癌基因作用。Fan等[16]研究證實(shí)JMJD1A通過在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上控制c-Myc表達(dá)調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和存活。Peng等[17]研究證實(shí)JMJD1A在結(jié)腸癌中過度表達(dá),且與患者較短的總生存期相關(guān)。Yamada等[18]研究提示JMJD1A在肝癌中表達(dá)越高,其復(fù)發(fā)率相對越高。更多的研究結(jié)果證實(shí)JMJD1A還高表達(dá)于腎癌[19]、膀胱癌及乳腺腫瘤[20,21]等腫瘤中,且均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,下調(diào)JMJD1A表達(dá)后能顯著抑制癌細(xì)胞增殖和減少異種移植瘤的發(fā)生。與上述結(jié)果一致,本研究結(jié)果表明,與正常宮頸組織相比,JMJD1A表達(dá)水平在宮頸癌組織中明顯升高,采用shRNA干擾宮頸癌細(xì)胞系中JMJD1A表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)明顯抑制體外宮頸癌細(xì)胞的生長及增殖。進(jìn)一步的裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)提示干擾JMJD1A下調(diào)后可顯著降低宮頸癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)腫瘤形成能力,其腫瘤體積及質(zhì)量均小于對照組(P<0.001),證實(shí)JMJD1A確實(shí)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長及增殖,揭示JMJD1A可能在宮頸癌發(fā)生中發(fā)揮癌基因作用。

綜上所述,本研究證實(shí)JMJD1A下調(diào)后能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的生長增殖及瘤體的形成,提示其可能是治療宮頸癌的潛在分子靶點(diǎn),深入了解JMJD1A在宮頸癌發(fā)生發(fā)病及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,不僅對基因表達(dá)、調(diào)控、遺傳等生理機(jī)制有更深入的了解,而且對宮頸癌等腫瘤的診治及預(yù)后判讀都具有重要意義。