PCR快速檢測淋病奈瑟菌NspA基因方法的建立及分析

王彥 王琨 劉小林 劉霞 王西珍

【摘要】目的 構(gòu)建PCR檢測淋病奈瑟菌NspA基因的方法，為尋找快速檢測淋病奈瑟菌的方法提供理論依據(jù)。方法 根據(jù)NspA基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從10例已成功培養(yǎng)出淋病奈瑟菌的患者尿道分泌物中用PCR方法擴(kuò)增NspA基因，并測序鑒定。結(jié)果 1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示成功獲得一個(gè)約528 bp的基因片段，基因測序鑒定與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。結(jié)論 淋球菌常規(guī)培養(yǎng)檢測和鑒定需2～3天的時(shí)間，而PCR快速檢測淋病奈瑟菌NspA基因，只需2～3小時(shí)便能獲得數(shù)據(jù)，縮短了檢測時(shí)間，給臨床診治贏得寶貴時(shí)間。

【關(guān)鍵詞】PCR;淋病奈瑟菌;NspA基因

【中圖分類號(hào)】R392 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2019.29..02

淋病病原體是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）俗稱淋球菌，它的唯一天然宿主是人類。淋病奈瑟菌NspA基因是淋球菌表面蛋白A的表達(dá)基因，有研究發(fā)現(xiàn)NspA抗原不但在細(xì)菌表面持續(xù)表達(dá)，而且高度保守，淋球菌NspA氨基酸序列在淋球菌菌株之間的同源性高達(dá)98%。本研究旨在尋找一種快速檢測淋球菌的方法，為臨床診治贏得寶貴時(shí)間。

1 材料與方法

1.1? 標(biāo)本采集

收集自2016年9月～2018年3月我院皮膚性病科、男性科、泌尿外科門診疑似淋病患者，其中男性取尿道分泌物，女性取距宮頸口1～1.5 cm處分泌物，裝入無菌試管，-80℃冷凍備用。從中選取10例經(jīng)VITEK-2 COMPACT全自動(dòng)微生物分析儀鑒定為淋病奈瑟菌的患者分泌物用PCR方法擴(kuò)增NspA基因。

1.2? 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)和合成引物

以淋球菌DNA為模板，根據(jù)GeneBank報(bào)道的NspA （gi：26324161） 核甘酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物和探針，由invitrogen公司合成。引物如下：

上游引物 P1： 5′-GCATGAAAAAAGCACTTGCC-3′

下游引物P2： 5′-CCGTCAGAATTTGACGCGCAC-3′

用PCR來驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性，并使用淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 29403作為陽性對(duì)照;用可能成為尿道感染致病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922，作為陰性對(duì)照（由江蘇省臨檢中心提供）。

1.2.2 DNA的提取和擴(kuò)增

1.2.2.1 臨床樣本的DNA提取

把10例臨床樣本的棉拭子在磷酸鹽緩沖液（PBS）中（2 mL）擠壓洗1～2 min，并用Votex漩渦振蕩器振蕩1min，棄去棉拭子使分泌物盡量溶于生理鹽水中，懸浮液放入離心機(jī)3000 r/min離心5 min（離心半徑16 cm），棄上清液，用1mL無菌生理鹽水懸浮細(xì)胞，放入離心機(jī)，3000 r/min離心5 min（離心半徑16 cm），棄上清液，細(xì)胞重新溶于1×TE緩沖液中（100 μL），100℃加熱煮沸10 min后放入離心機(jī)12000 r/min離心10 min（離心半徑16 cm），上清液含DNA模板，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2.2 陽性對(duì)照、陰性對(duì)照

按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求，取淋球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 29403增菌后接種于巧克力培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用苯酚-氯仿法提取淋球菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增NspA基因，作為陽性對(duì)照。以同樣方法取標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922作為陰性對(duì)照。

1.2.2.3 NspA基因的PCR擴(kuò)增

取已準(zhǔn)備好的10例臨床樣本DNA，用設(shè)計(jì)的P1和P2為引物，PCR擴(kuò)增NspA基因，25 μL反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL;10 μmol/L上游引物1 μl;10 μmol/L下游引物1 μL;dNTP 1.5 μL;Taq 酶0.5 μL;模板DNA 1μL;去離子水17.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min;94℃ 60 S;58℃ 45 S;72℃ 1 min;共35個(gè)循環(huán);最后72℃ 10 min。

1.2.2.4 NspA基因核苷酸序列鑒定

按PCR膠回收純化試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物，將經(jīng)柱式膠回收純化臨床PCR產(chǎn)物送往INVITROGEN公司進(jìn)行測序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1? PCR擴(kuò)增NspA基因

采用P1和P2為引物，對(duì)已準(zhǔn)備好的10例臨床樣本DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，得到一條與NspA預(yù)期相符大小約為528 bp的清晰條帶，與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符，見圖1。

2.2? 序列測定

本研究PCR擴(kuò)增的10例臨床NspA基因全長528 bp（含起始密碼和終止密碼），編碼175個(gè)氨基酸。對(duì)測序結(jié)果作Blastn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增的臨床NspA基因序列與GeneBank報(bào)道的淋球菌（CMCC 29403）NspA（gi：215260656）核苷酸序列完全一致，見圖2。

3 討 論

淋球菌能夠引起泌尿生殖系統(tǒng)的化膿性感染，臨床表現(xiàn)為有典型的尿痛及尿道膿性分泌物，人類是它唯一的天然宿主。淋病好發(fā)于尿道引起淋病性尿道炎，如治療不及時(shí)，還可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起前列腺炎、附睪炎、盆腔炎、輸卵管炎等，也可侵犯眼睛、咽部、直腸，甚至經(jīng)血液播散到全身形成淋球菌性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腱鞘炎等合并癥。

目前一種用來放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），其一次性地將反應(yīng)液加好后進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)一般在2～4小時(shí)內(nèi)完成，擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，無放射性污染、易推廣。

細(xì)菌培養(yǎng)法是世界衛(wèi)生組織推薦診斷淋球菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而報(bào)告時(shí)間較長、操作繁瑣。不少患者在就診前都接受過非正規(guī)的抗生素治療，再加上淋球菌生長條件苛刻，對(duì)外界抵抗力較低，增加細(xì)菌培養(yǎng)難度，影響檢出率。而PCR檢測法由于有較高的特異性和敏感性，因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，不管患者分泌物中的活菌或死菌都可檢出[1]。一般細(xì)菌培養(yǎng)及VITEK.MS質(zhì)譜鑒定，需要較長時(shí)間才能最后確定到菌種[2]，應(yīng)用VITEK.MS質(zhì)譜技術(shù)來進(jìn)行細(xì)菌鑒定，雖然有較完整的微生物圖譜庫進(jìn)行結(jié)果比對(duì)[3]，但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，中小型醫(yī)院難以普及。淋球菌常規(guī)培養(yǎng)檢測和鑒定也是需2～3天的時(shí)間，常常延誤診斷和治療。而PCR檢測淋球菌保守的NspA基因只需2～3小時(shí)便能獲得數(shù)據(jù)，具有較高的特異性及敏感性，縮短了檢測時(shí)間，快速做出診斷，早發(fā)現(xiàn)、早治療，給臨床診治贏得寶貴時(shí)間。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙曉蘭，馮 琳.四種方法檢測淋病奈瑟球菌的臨床應(yīng)用對(duì)比研究[J].中國性科學(xué)，2015（7）：45-47.

[2] Lim SH，Mix S，Xu Z，et a1.Colorimetric sensor array allows fast detection and simultaneous identification of sepsis-causing bacteria in spiked blood culture[J].J Clin Microbiol，2014，52（2）：592-598.

[3] Altun O，Botero-Kleiven S，Carlsson S，et a1.Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by MALDI-TOF MS following short—term incubation on solid media[J].J Med Microbiol， 2015，64（1 1）：1346-1352.

本文編輯：劉欣悅