肺組織硅藻定量分析在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物溺死診斷中的應(yīng)用

趙建，羅銀洲，王玉仲，肖成，石河，胡孫林，康曉東，徐曲毅，成建定，劉超

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510030；3.十堰市公安局，湖北 十堰 442000；4.廣東江門(mén)中醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 江門(mén) 529000；5.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

硅藻檢驗(yàn)是溺死診斷最常用的實(shí)驗(yàn)室檢查方法[1-5]。一般認(rèn)為，在肺、肝、腎、牙齒和骨髓等器官中檢出硅藻，是診斷溺死的基本原則[6]。溺死和死后入水時(shí)，硅藻均可以隨溺液從呼吸道進(jìn)入尸體肺組織[7]。由于進(jìn)入方式不同（主動(dòng)吸入或被動(dòng)進(jìn)入），導(dǎo)致溺死和死后入水的尸體肺組織硅藻含量存在差異，溺死者肺組織硅藻含量較高，死后入水者肺組織硅藻含量較低或者不含硅藻[1，8-13]。然而，過(guò)去關(guān)于肺組織硅藻含量的描述多為直觀(guān)感受，無(wú)明確的分析參數(shù)和量化標(biāo)準(zhǔn)[6]。本研究采用較傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)方法更靈敏的微波消解-真空抽濾-掃描電鏡聯(lián)用法[14]，分析溺死及死后入水者肺組織和溺液的硅藻含量，探討肺組織硅藻檢驗(yàn)在溺死診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

18只新西蘭大白兔（廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量1.0～3.0kg，隨機(jī)分為溺死組10只，死后入水組6只，陸地死亡組2只。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為廣州市南沙區(qū)虎門(mén)大橋。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理要求。

26只五指山豬（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)中心），雌雄不限，體質(zhì)量13.3～15.1kg，隨機(jī)分組，如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)豬分組

1.1.2 試劑

硝酸（65%～68%）、過(guò)氧化氫（30%）和無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.1.3 儀器

Multiwave3000微波消解儀（奧地利Anton Parr公司），HL-6多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)EI QUANTATM600型掃描電鏡（荷蘭FEI公司），Genesis7000型能譜儀（美國(guó)EDAX公司）。

1.2 方法

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，模擬溺死、死后入水和陸地死亡[15]。溺死組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沉入水下0.5m處1min，提出水面30s后重新沉入相同水深處，重復(fù)數(shù)次直至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物溺死，死后在水中浸泡30 min。死后入水組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射過(guò)量麻醉劑處死，沉入水下0.5m處浸泡30min。陸地死亡組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射過(guò)量麻醉劑處死。

提取實(shí)驗(yàn)兔的全肺組織，提取實(shí)驗(yàn)豬肺左尖葉、左心葉、左膈葉、左副葉、右尖葉、右心葉、右膈葉的邊緣及中段組織各2 g，提取各水體類(lèi)型的溺液樣本500mL。

提取前所有試劑、工具、器皿均用超純水沖洗，確認(rèn)不含硅藻。

采用微波消解-真空抽濾-掃描電鏡聯(lián)用法[14]，分析肺組織和溺液的硅藻含量（個(gè)/g）。

計(jì)算肺組織與溺液硅藻含量的比值（ratio of content of diatoms in lung tissue and drowning fluid，CL/CD）[7]：

CL/CD=肺組織硅藻含量/溺液硅藻含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)溺死與死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺組織的CL/CD值進(jìn)行t檢驗(yàn)，對(duì)溺死與死后入水組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織的CL/CD值、不同水體類(lèi)型中溺死與死后入水實(shí)驗(yàn)豬的CL/CD值進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

陸地死亡的實(shí)驗(yàn)兔及實(shí)驗(yàn)豬的肺組織中均未檢出硅藻。

溺死組實(shí)驗(yàn)兔肺組織CL/CD最小值為1.02，最大值為13.69；死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺組織CL/CD最小值為0.22，最大值為1.17。由表2可知，溺死組與死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺組織CL/CD值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），溺死組肺組織CL/CD值大于死后入水組。

表2 溺死與死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺組織的CL/CD值

溺死組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織CL/CD最小值為0.02，最大值為418.76；死后入水組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織CL/CD最小值為0，最大值為1.59。由表3可知，溺死組與死后入水組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織CL/CD值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），溺死組各肺葉邊緣及中段組織的CL/CD值均大于死后入水組。如表4所示，不同水體類(lèi)型中，溺死組與死后入水組實(shí)驗(yàn)豬之間肺組織CL/CD值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），溺死組CL/CD值大于死后入水組。

表3 溺死與死后入水組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織的CL/CD值（n=12±s）

表3 溺死與死后入水組實(shí)驗(yàn)豬各肺葉組織的CL/CD值（n=12±s）

注：1）與溺死組比較，P＜0.05。

images/BZ_69_206_460_1194_514.png26.19±32.380.29±0 38.31±60.670.23±0 35.78±46.500.20±0 24.29±33.570.14±0 13.26±11.050.30±0 25.75±27.410.09±0 26.20±37.690.30±0 57.42±100.850.19±0 25.54±23.230.31±0 42.42±63.530.09±0 32.13±35.600.25±0 54.82±119.100.21±0 10.00±8.350.26±0 20.17±15.360.33±0左尖葉邊緣左尖葉中段左心葉邊緣左心葉中段左膈葉邊緣左膈葉中段左副葉邊緣左副葉中段右尖葉邊緣右尖葉中段右心葉邊緣右心葉中段右膈葉邊緣右膈葉中段.351）.421）.351）.171）.501）.121）.491）.281）.461）.111）.501）.301）.441）.471）

表4 不同水體類(lèi)型中溺死與死后入水實(shí)驗(yàn)豬的CL/CD值（±s）

表4 不同水體類(lèi)型中溺死與死后入水實(shí)驗(yàn)豬的CL/CD值（±s）

注：1）與溺死組比較，P＜0.05。

死后入水組77.31±90.380.54±0 26.39±32.000.10±0 9.65±8.910.10±0 14.16±10.230.14±0.611）.131）.101）.161）水體類(lèi)型海水咸淡水交界河道淡水湖泊淡水n3 2 2 5溺死組

3 討 論

溺死是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中最難判斷的死因之一[16-17]。法醫(yī)學(xué)者們研發(fā)了許多用于診斷溺死的標(biāo)志物[18-23]，其中硅藻檢驗(yàn)被認(rèn)為是最可靠、最有效的方法[16]。肺、肝、腎、脾、腦、骨髓、血液、胃內(nèi)容物等均可以用于硅藻檢驗(yàn)。肺組織和至少一個(gè)遠(yuǎn)端器官組織檢出硅藻是診斷溺死的基本要求[6，24]。為了排除死后入水進(jìn)入肺組織的硅藻和外源性硅藻污染，認(rèn)為10g肺組織中的硅藻多于20個(gè)是診斷溺死的依據(jù)之一[2，24]。但是，隨著硅藻檢驗(yàn)方法靈敏度的提高，ZHAO等[7]發(fā)現(xiàn)死后入水者肺組織中硅藻含量比傳統(tǒng)認(rèn)為的要高，最高接近2000個(gè)/10g肺組織。因此，傳統(tǒng)的20個(gè)/10g肺組織并不適用于靈敏度高的硅藻新方法檢驗(yàn)結(jié)果的分析。由于肺組織硅藻含量受溺液影響很大，為了排除溺液的影響，本研究引入了CL/CD值來(lái)分析比較溺死與死后入水者肺組織的硅藻含量。CL/CD值體現(xiàn)了肺組織對(duì)溺液中硅藻的“凈富集”情況。

如表2～3所示，溺死兔、溺死豬肺組織的CL/CD值均高于死后入水組，說(shuō)明溺死組肺組織對(duì)溺液中硅藻的“富集”更為明顯。這是由于溺水時(shí)，主動(dòng)呼吸吸入大量的溺液，部分溺液通過(guò)肺泡進(jìn)入血液，導(dǎo)致硅藻在肺組織內(nèi)富集。溺死豬7個(gè)肺葉邊緣及中部的CL/CD值均大于死后入水組，說(shuō)明溺水時(shí)實(shí)驗(yàn)豬全肺均擴(kuò)張吸入了大量溺液，是在溺液中缺氧導(dǎo)致呼吸運(yùn)動(dòng)加劇的表現(xiàn)。而死后入水者，溺液在水壓的作用下進(jìn)入肺組織，無(wú)主動(dòng)呼吸和溺液滲透作用，那么肺組織的硅藻含量應(yīng)該少于溺液中的硅藻含量或者與溺液中的硅藻含量相當(dāng)，CL/CD值分布應(yīng)在0～1，考慮到溺液中硅藻含量的變化，部分可能大于1。死后入水兔肺組織的CL/CD最大值為1.17，死后入水豬肺組織的CL/CD最大值為1.59。死后入水豬肺組織的CL/CD最小值為0，這是由于死后入水時(shí)，硅藻難以到達(dá)肺邊緣，肺組織中的硅藻主要來(lái)源于在水的壓力作用下被動(dòng)進(jìn)入的呼吸道內(nèi)的溺液。當(dāng)CL/CD值在1～1.6時(shí)，溺死組與死后入水組存在部分重疊，而在CL/CD＞1.6時(shí)，所有的均為溺死組實(shí)驗(yàn)兔或?qū)嶒?yàn)豬。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)肺組織硅藻富集明顯（CL/CD＞1.6）時(shí)，是診斷溺死的可靠指標(biāo)。對(duì)CL/CD值在1～1.6的案例進(jìn)行溺死診斷時(shí)，應(yīng)與多器官的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行分析。

無(wú)論是在海水、咸淡水交界還是淡水，溺死組CL/CD值均大于死后入水組，CL/CD值可以用于區(qū)別溺死與死后入水，CL/CD值具有穩(wěn)定的特點(diǎn)，不受溺液類(lèi)型的影響。

溺死與死后入水的區(qū)別在于入水后是否有主動(dòng)呼吸，肺組織硅藻的富集是主動(dòng)呼吸作用的重要體現(xiàn)。因此，進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)時(shí)，在多器官檢出硅藻的同時(shí)引入肺組織CL/CD值這一參數(shù)進(jìn)行分析，能更準(zhǔn)確地作出溺死的診斷。

需要注意的是，肺組織的富集作用在溺液中硅藻含量高時(shí)才能較好地體現(xiàn)，溺液中硅藻含量低時(shí)，富集作用不明顯[7]。在進(jìn)行溺死診斷時(shí)，仍然應(yīng)該與尸體檢驗(yàn)、案情調(diào)查、毒（藥）物檢驗(yàn)等結(jié)合綜合分析。