杜錦波，劉明發(fā)，李梅嶺，劉杰，朱春景

(滄州市人民醫(yī)院，1.胃腸(微創(chuàng))外科；2.內(nèi)分泌科，河北 滄州 061000)

近些年，伴隨人們的生活條件及習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高，已成為男性第3位、女性第2位的高發(fā)腫瘤，且發(fā)病人群逐漸年輕化[1-2]。結(jié)腸位于腹腔，有著較為豐富的淋巴系統(tǒng)，血液系統(tǒng)和比鄰器官(肝臟、胰腺、胃、脾臟、輸尿管、膀胱等)。這些特點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)腸癌的惡性程度比較高，容易局部侵犯，使得結(jié)腸癌的規(guī)范的外科治療成為難點(diǎn)。結(jié)腸息肉是一種常見的結(jié)腸疾病，息肉來源于粘膜上皮。隨著結(jié)腸鏡在各大醫(yī)院的廣泛應(yīng)用，結(jié)腸息肉受到更多的重視，特別是絨毛狀腺瘤，家族性息肉病被更多的學(xué)者認(rèn)為更易發(fā)生癌變[3]。隨訪研究結(jié)果顯示，結(jié)腸息肉的整體惡變率為10%，一般需要10年左右時(shí)間，尤其是腺瘤性息肉，腺瘤愈大，絨毛越多，癌變率愈高。目前，關(guān)于大腸息肉發(fā)生癌變的具體機(jī)制尚不清楚。本研究選取結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌標(biāo)本分別檢測(cè)PMS2、C-met、MSH6的表達(dá)，以探索其在結(jié)腸息肉癌變中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集滄州市人民醫(yī)院胃腸微創(chuàng)外科2010年1月至2012年8月住院病例病理標(biāo)本。其中，結(jié)腸管狀腺瘤42例，絨毛狀腺瘤41例，家族性息肉病40例，結(jié)腸癌42例。標(biāo)本均使用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋并且制成切片備用。

試劑與儀器 ：兔抗人MSH6 PMS2 C-met的抗體購于武漢博士德公司。SP免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒、抗原修復(fù)液，DAB顯色液、PBS緩沖液均購自北京邁新生物技術(shù)有限公司。免疫組化主要儀器有顯微鏡、切片機(jī)，組織脫水機(jī)、孵育盒等。

1.2 方法

本研究所需切片均脫蠟水化；3%H2O2室溫孵育10 min； 蒸餾水2次沖洗，PBS浸泡6 min；再行抗原修復(fù)；10% 正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，分別滴加(1∶100) 的PMS2、C-met、MSH6的單克隆抗體、4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；生物素標(biāo)記二抗工作液37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min； 滴加2滴辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃ 孵育30 min；PBS 沖洗3次，DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗，封片。每例染2張。在光學(xué)顯微鏡5個(gè)高倍視野下觀察，分析。進(jìn)行視野內(nèi)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。腫瘤細(xì)胞無著色為(-)；<25%的細(xì)胞著色(+)；25%～50%的細(xì)胞著色為(++)；>50%的細(xì)胞著色為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMS2在結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌中的表達(dá)

PMS2主要表達(dá)于細(xì)胞核，且在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯低于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達(dá)明顯低于結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤(P<0.05)。見圖1和表 1。

表1 PMS2在結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌中的表達(dá)

項(xiàng)目陰性陽性表達(dá)率(%)結(jié)腸管狀腺瘤(n=42)33992.6絨毛狀腺瘤(n=41)53687.8家族性息肉病(n=40)122870.0#結(jié)腸癌(n=42)231945.2?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.2 C-met在結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌中的表達(dá)

C-met的表達(dá)以細(xì)胞漿為主，呈棕黃色或棕褐色為陽性染色。且在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯高于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達(dá)明顯高于結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤(P<0.05)。見圖2和表 2。

表2 C-met在結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌中的表達(dá)

項(xiàng)目陰性陽性表達(dá)率(%)結(jié)腸管狀腺瘤(n=42)311126.2絨毛狀腺瘤(n=41)281331.7家族性息肉病(n=40)221845.0#結(jié)腸癌(n=42)123071.4?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.3 MSH6在結(jié)腸管狀腺瘤，絨毛狀腺瘤，家族性息肉病，結(jié)腸癌中的表達(dá)

MSH6主要表達(dá)于細(xì)胞核，部分在胞質(zhì)中表達(dá)，且染色呈棕黃色。且在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯低于家族性息肉病(P<0.05)，在家族性息肉病中的表達(dá)明顯低于結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表 3。

表3 MSH6在結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌中的表達(dá)

項(xiàng)目陰性陽性表達(dá)率(%)結(jié)腸管狀腺瘤(n=42)43890.5絨毛狀腺瘤(n=41)83380.5家族性息肉病(n=40)172357.5#結(jié)腸癌(n=42)311126.2?

*P<0.05，與家族性息肉病相比；#P<0.05，與結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤相比。

2.4 MSH6表達(dá)與PMS2、C-met的相關(guān)性

MSH6的表達(dá)與C-met表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，與PMS2的表達(dá)呈正相關(guān)性，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 MSH6表達(dá)與PMS2、C-met的相關(guān)性

3 討論

在實(shí)際臨床工作中以結(jié)腸鏡來發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉，當(dāng)結(jié)腸息肉發(fā)展為惡性腫瘤時(shí)又以結(jié)腸癌的TNM分期，有無脈管癌栓，有無神經(jīng)侵犯等因素來預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者的預(yù)后。但是經(jīng)常遇到相同TNM分期的結(jié)腸癌患者，預(yù)后卻不完全相同[4]。有些TNM分期較早的患者卻很早的出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后很差。結(jié)腸均位于腹腔，按照解剖學(xué)可分為升結(jié)腸，橫結(jié)腸，降結(jié)腸，乙狀結(jié)腸。按照血管供應(yīng)則分為右半結(jié)腸，左半結(jié)腸。結(jié)腸的主要功能為吸收水分，形成和傳輸大便。結(jié)腸的血液供應(yīng)主要來自于腹主動(dòng)脈的分支腸系膜上動(dòng)脈及腸系膜下動(dòng)脈。結(jié)腸的淋巴系統(tǒng)非常豐富，非常容易淋巴轉(zhuǎn)移，并且有重要的大血管，使得結(jié)腸癌的淋巴清掃成為難點(diǎn)。結(jié)腸周圍有著較多重要的毗鄰器官(肝臟、胃、胰腺、小腸、脾臟、輸尿管等)，使得結(jié)腸癌容易造成局部侵犯導(dǎo)致手術(shù)無法完整切除。以上這些結(jié)腸癌的臨床特點(diǎn)使得結(jié)腸癌的外科手術(shù)治療成為難點(diǎn)。近些年結(jié)腸鏡的大量應(yīng)用使得結(jié)腸癌能夠早期發(fā)現(xiàn)，其預(yù)后也有所改善。結(jié)腸癌很多是由結(jié)腸息肉發(fā)生，發(fā)展演變而來。結(jié)腸息肉直徑越大，個(gè)數(shù)越多，分布越密集，絨毛越多，越容易發(fā)生癌變。家族性息肉病幾乎都會(huì)發(fā)展為結(jié)腸癌，故家族性息肉病也成為了外科手術(shù)的適應(yīng)癥。然而哪些息肉容易惡變，哪些息肉是外科手術(shù)的適應(yīng)癥，尚無明確共識(shí)，所以有必要對(duì)結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的關(guān)系，相互發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以便盡可能提供結(jié)腸癌的更全面的預(yù)防、篩查等的理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于結(jié)腸癌患者的二級(jí)預(yù)防。錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(Mismatch Repair，MMR) 是正常人體重要的修復(fù)方式，這一系統(tǒng)廣泛的存在于自然界的所有生物體內(nèi)，是人類不可缺少的重要修復(fù)方式。在正常的人體內(nèi)，所有組織及細(xì)胞每時(shí)每刻都在有條不紊的進(jìn)行著基因的重組和復(fù)制，在這一持續(xù)的過程中不可避免地會(huì)出現(xiàn)堿基的錯(cuò)配及基因重組的錯(cuò)配。這一錯(cuò)配的發(fā)生使得正常人體無法進(jìn)行有序的新陳代謝。MMR的作用就在于及時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并且能夠糾正使已經(jīng)發(fā)生錯(cuò)配的基因序列能夠恢復(fù)到正常的堿基配對(duì)。這一作用能夠有效維持正常人體內(nèi)遺傳物質(zhì)傳遞的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。MMR這一修復(fù)系統(tǒng)幾乎存在于自然界的所有正常生物體內(nèi)，其主要的作用是對(duì)人體核苷酸復(fù)制、重組過程中不可避免產(chǎn)生的錯(cuò)誤進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)并及時(shí)修復(fù)。MMR修復(fù)系統(tǒng)的作用不僅可以有效檢測(cè)遺傳物質(zhì)的復(fù)制是否正確而且還可以及時(shí)的糾正遺傳物質(zhì)在重組和復(fù)制過程中不可避免產(chǎn)生的錯(cuò)誤。這一作用能夠有效地保持了遺傳物質(zhì)復(fù)制重組過程中的正確性以及核苷酸序列的穩(wěn)定性。在正常的人體內(nèi)MMR這一修復(fù)系統(tǒng)具有重要的作用，然而這一修復(fù)系統(tǒng)一旦發(fā)生自身的突變，將會(huì)直接影響基因的監(jiān)測(cè)，以及對(duì)已經(jīng)發(fā)生的錯(cuò)誤進(jìn)行修正。這一修復(fù)系統(tǒng)的失效便會(huì)直接導(dǎo)致正常人體內(nèi)的DNA產(chǎn)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability MSI)以及正常人體內(nèi)的遺傳物質(zhì)在復(fù)制和重組過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤。 MSI的作用結(jié)果還表現(xiàn)為正常人體內(nèi)致癌基因的過度激活與抑癌基因抑制，這一作用使得正常人體內(nèi)致癌基因與抑癌基因這一互相平衡制約的基因被打破。這樣在我們正常人體細(xì)胞中的基因物質(zhì)的突變頻率便會(huì)有所增加，這一作用的結(jié)果將直接導(dǎo)致人體正常的細(xì)胞發(fā)展為惡性腫瘤的可能性有所增加[5-6]。MMR修復(fù)系統(tǒng)的失效將可能成為正常人體細(xì)胞突變?yōu)閻盒阅[瘤的機(jī)制之一。

惡性腫瘤的發(fā)生，發(fā)展是由機(jī)體自身及外界多種因素共同作用的結(jié)果，結(jié)直腸癌的發(fā)生，發(fā)展同樣也是自身DNA受損后由于修復(fù)機(jī)制出現(xiàn)異常，最終引起DNA突變而導(dǎo)致癌變[7]。機(jī)體在正常情況下存在一套完整的DNA修復(fù)系統(tǒng)，包括錯(cuò)配修復(fù)、重組修復(fù)、直接修復(fù)、SOS 修復(fù)、切除修復(fù)[8-9]，這些修復(fù)系統(tǒng)可以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行。堿基配對(duì)錯(cuò)誤作用于非重復(fù) DNA，從而引起配對(duì)錯(cuò)誤；堿基插入會(huì)使DNA的序列出現(xiàn)紊亂，從而引起微衛(wèi)星的缺失或插入，進(jìn)一步導(dǎo)致MSI[10]。MMR基因主要作用在于細(xì)胞復(fù)制后進(jìn)行修復(fù)即對(duì)DNA錯(cuò)配堿基進(jìn)行修復(fù)，從而有預(yù)防基因變異以及維持DNA復(fù)制正確的作用[5-6]，如不能充分發(fā)揮MMR的作用將導(dǎo)致微衛(wèi)星 DNA 不穩(wěn)定甚至出現(xiàn)復(fù)制錯(cuò)誤， 進(jìn)而引起細(xì)胞增殖及分化異常， 這將成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)[11]。MSH6、PMS2基因?qū)儆贛MR，它的的突變是導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)病的主要原因[12]。本研究證實(shí)，結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌標(biāo)本中的MSH6、PMS2的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯低于家族性息肉，在家族性息肉病中的表達(dá)明顯低于絨毛狀腺瘤。

C-met(肝細(xì)胞生長因子受體)是由原癌基因編碼合成，為肝細(xì)胞生長因子受體，其重要的生物學(xué)活性之一為酪氨酸激酶活性，它的重要功能為細(xì)胞之間的信息傳導(dǎo)，并且能夠控制細(xì)胞骨架的重排，這樣對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)這些功能有著重要的推進(jìn)作用。許多國內(nèi)外大型機(jī)構(gòu)研究已經(jīng)表明C-met參與了機(jī)體多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究表明，結(jié)腸管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、家族性息肉病、結(jié)腸癌標(biāo)本中的C-met的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，且在結(jié)腸癌中的表達(dá)明顯高于家族性息肉，在家族性息肉病中的表達(dá)明顯高于絨毛狀腺瘤。C-met的作用機(jī)制與PMS2及MSH6的作用機(jī)制恰恰相反，這三種蛋白對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用結(jié)果與它們對(duì)結(jié)腸癌的作用機(jī)理保持了相互一致性。C-met的表達(dá)越強(qiáng)往往預(yù)示結(jié)腸息肉患者更容易發(fā)生發(fā)展為結(jié)腸癌。C-met的高表達(dá)也預(yù)示結(jié)腸癌的發(fā)展迅速，預(yù)后較差。而PMS2與MSH6的低表達(dá)往往預(yù)示結(jié)腸息肉患者更容易發(fā)生發(fā)展為結(jié)腸癌。PMS2與MSH6的低表達(dá)也預(yù)示結(jié)腸癌的發(fā)展迅速，預(yù)后較差。MSH6在結(jié)腸癌中的表達(dá)與C-met的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；MSH6的表達(dá)與PMS2的表達(dá)呈正相關(guān)性。PMS2與MSH6均屬于錯(cuò)配修復(fù)基因；錯(cuò)配修復(fù)基因編碼合成的這兩種蛋白質(zhì)對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生，發(fā)展具有相似的作用機(jī)制，PMS2、MSH6的高表達(dá)往往提示結(jié)腸息肉不容易發(fā)展為結(jié)腸癌。即使發(fā)展為結(jié)腸癌，也預(yù)示結(jié)腸癌的分期較早，無脈管癌栓，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少，預(yù)后較好。這兩種蛋白如果表達(dá)缺失則意味著結(jié)腸息肉更容易演變?yōu)榻Y(jié)腸癌，且發(fā)展為癌后的預(yù)后也較差。PMS2、MSH6的表達(dá)具有正相關(guān)性，在結(jié)腸癌中的作用具有一致性。這一結(jié)果與它們的作用機(jī)理一致[12]，也說明它們之間的表達(dá)可能具有協(xié)同性或者相互促進(jìn)作用。MSH6在結(jié)腸癌中的表達(dá)與C-met的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。C-met在正常人體的器官、組織、細(xì)胞中表達(dá)低下。然而當(dāng)這些正常組織發(fā)生，發(fā)展演變?yōu)閻盒阅[瘤組織時(shí)，由C-met基因編碼而成的蛋白質(zhì)水平則會(huì)明顯升高，當(dāng)C-met處于較高表達(dá)水平時(shí)，便可以通過旁分泌和自分泌等多種途徑來激活多種信號(hào)通路，從而刺激正常的組織、細(xì)胞發(fā)生，發(fā)展，最終演變?yōu)閻盒阅[瘤細(xì)胞。PMS2，MSH6與C-met在結(jié)腸正常組織和細(xì)胞中的作用機(jī)制完全不一樣，它們?cè)诮Y(jié)腸息肉與結(jié)腸癌中陽性表達(dá)意義也截然相反。本研究得出的結(jié)果與這三種蛋白的作用機(jī)制的理論保持了一致性。本研究還揭示了PMS2、MSH6與C-met這三種蛋白對(duì)結(jié)腸息肉發(fā)生發(fā)展為結(jié)腸癌的作用以及這三種蛋白相互之間的關(guān)系，對(duì)用更全面系統(tǒng)的指標(biāo)來預(yù)測(cè)哪些結(jié)腸息肉患者更容易轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸癌有著重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，MSH6、PMS2、C-met可能是結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，了解三者在結(jié)腸息肉與結(jié)腸癌中的表達(dá)可為結(jié)腸息肉的危險(xiǎn)度評(píng)估、預(yù)防、治療、隨診提供參考依據(jù)。