移植同種異體脂肪干細胞對兔椎間盤退變早期的干預實驗研究

白亦光,劉 康,楊澤龍,羅栩偉,林 濤,肖東琴,馮 剛*

(1川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院,南充市中心醫(yī)院骨科,南充 637000;2川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院,南充市中心醫(yī)院組織工程與干細胞研究所;*通訊作者,E-mail:fenggangncch@163.com)

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration,IDD)是引起下腰部疼痛癥狀常見的原因,是中老年人的常見病、多發(fā)病。具體表現(xiàn)為椎間盤組織含水量逐漸緩慢減少,髓核組織內(nèi)部張力進行性下降,彈性消失,椎間盤高度降低,纖維環(huán)生理結(jié)構(gòu)紊亂,產(chǎn)生向心性小裂隙。其確切的病理生理機制到目前為止尚不十分清楚,很多學者認為是生物介導、年齡增長、椎間盤內(nèi)部營養(yǎng)失衡等多種因素造成的結(jié)果。由于椎間盤是體內(nèi)最大的無血管組織,它的細胞處于一種較為“惡劣”的微環(huán)境,髓核組織僅靠上下的軟骨終板血管彌散作用獲取少量的營養(yǎng),而纖維環(huán)表層的外周細胞通過鄰近的韌帶內(nèi)的血管獲取營養(yǎng),故而椎間盤一旦開始發(fā)生退變后較難自行恢復。隨著病程的進展,終板發(fā)生鈣離子沉積骨化,營養(yǎng)的提供(如葡萄糖、氧分等)也變得越來越受限[1],進而髓核組織內(nèi)細胞外基質(zhì)含量減少,髓核細胞活性降低,最終椎間盤功能喪失。

脂肪干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,ADSCs)是一種在組織工程領(lǐng)域應用非常廣泛的干細胞,免疫研究表明[2],ADSC能抑制T細胞、NK細胞和B細胞的活性,同種異體移植的ADSC也未引起宿主的免疫反應,由于其本身的多向分化潛能及較低的免疫原性使之成為IDD研究中的理想種子細胞。很多實驗在選擇種子細胞移植均是在椎間盤退變中期進行[3],本實驗將脂肪干細胞進行造模時的同期移植,以觀察在椎間盤退變發(fā)生早期,脂肪干細胞在椎間盤內(nèi)的生存情況以及對椎間盤退變過程的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料、儀器

健康2周齡日本大耳白兔4只,雌雄不限,體質(zhì)量0.5 kg左右。5月齡日本大耳白兔(川北醫(yī)學院動物中心提供)27只,雌雄不限,體質(zhì)量均約(2.5±0.25)kg。由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供;CO2孵箱購于美國Theromo公司;甲苯胺藍、番紅O染液;倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司;超凈工作臺購于美國Airtech公司;Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒購于美國Chondrex公司。

1.2 動物模型的建立

用21G針頭在椎間盤纖維環(huán)的中點刺入纖維環(huán)5 mm,回抽針筒至3 ml維持5 s,抽取髓核組織,吸出髓核組織大約濕重5-8 mg[4]。

1.3 ADSC的分離培養(yǎng)與鑒定

取實驗用2周齡幼兔一只，耳緣靜脈空氣栓塞致死；用酒精擦拭取腹股溝處(或背部)，無菌條件下取腹股溝處(或背部)脂肪；酒精泡30 s，PBS洗兩次，置入無菌培養(yǎng)皿中；在無菌操作臺剪去血管等異物組織，盡量清除干凈，充分剪碎脂肪(需要不斷剪切組織約30 min以上)，轉(zhuǎn)移至50 ml離心管；加入等體積0.1% Ⅱ型膠原酶于離心管中，置于37 ℃水浴鍋45 min(每5 min搖晃一次)；2 000 r/min離心10 min，傾倒上層組織液，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮，接種于T75培養(yǎng)瓶；置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基，以后每3 d換一次液，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況；當貼壁細胞達到90%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化，1 ∶3比例傳代培養(yǎng)；將原代ADSC按1×104個/ml接種至含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中進行細胞爬片。培養(yǎng)至細胞基本長成單層時取出蓋玻片，光鏡下觀察細胞大體形態(tài)。

1.4 ADSC的移植

取5月齡日本大耳白兔27只(川北醫(yī)學院實驗動物中心提供),雌雄不限,隨機分為3組:正常對照組(NC組,n=9),ADSC移植組(ADSC組,n=9),DMEM培養(yǎng)基組(DMEM組,n=9)。采用NC組作為陽性對照,ADSC組作為實驗組,DMEM組作為陰性對照組。

除正常組外其余兩組動物采用髓核穿刺抽吸法來建立退變動物模型[3],造模完成后,將制備好的約30 μl含有ADSC 1×106的細胞懸濁液經(jīng)帶有29G針頭的1 ml胰島素注射器穿刺移植入ADSC組動物的椎間盤中心,使用組織黏合劑封堵穿刺孔,防止細胞流出;DMEM組注入30 μl不含細胞的DMEM培養(yǎng)液?？p合肌肉、皮膚組織,傷口消毒后送回動物房;術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素預防感染。

1.5 檢測指標

1.5.2 病理組織學染色觀察 術(shù)后4,8,12周,耳緣靜脈注射空氣5 ml栓塞處死動物,暴露上下椎板及椎間盤,放入10%固定脫鈣液中固定脫鈣1周。石蠟包埋椎間盤組織,組織切片取正中矢狀位,厚度5 μm。實驗椎間盤組織切片進行HE染色和番紅O染色。

HE組織染色步驟如下:脫蠟至水;蘇木素染色15 min;自來水沖洗至組織反藍;1%鹽酸乙醇分色3 s;伊紅液復染1 min;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片;根據(jù)染色結(jié)果按照病理組織學分級量表進行評分(見表1),退變椎間盤的組織學分級按照4個標準評分,正常椎間盤4分,嚴重退變椎間盤12分,小數(shù)點后一位表示對椎間盤整體結(jié)構(gòu)的評價。

番紅O染色(主要用于觀察髓核組織蛋白多糖)步驟如下:脫蠟至水;PBS沖洗后4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS沖洗3次;蘇木素染色10 min,水洗;0.2%亮綠染色10 min,PBS沖洗3次;0.1%番紅O染色10 min,PBS沖洗3次;1%鹽酸酒精分化液3 s,烘干后樹脂封片后鏡下觀察。

表1 病理組織學分級量表Table 1 Histopathological grading scale

1.5.3 免疫組織化學染色和免疫熒光染色 collagen Ⅱ免疫組織化學染色檢測參照Chondrex公司collagen Ⅱ免疫組織化學染色試劑盒說明,步驟如下:將石蠟組織切片脫蠟至水;用PBS沖洗后4%多聚甲醛室溫固定30 min,行免疫組化檢測;2%牛透明質(zhì)酸酶封閉30 min,PBS沖洗3次;3%H2O2封閉10 min,PBS沖洗3次;Ⅱ型膠原一抗(小鼠抗兔,濃度1 ∶300)封閉4 ℃過夜,PBS沖洗3次;添加二抗(山羊抗小鼠,濃度1 ∶500)在室溫下孵育1 h,PBS沖洗3次;DAB顯色1 h,PBS沖洗3次,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察。

1.5.4 real time-PCR檢測 手術(shù)干細胞移植后4,8,12周后處死動物,游離出椎間盤,液氮下環(huán)境下研磨提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進而開始collagen Ⅱ、蛋白聚糖(aggrecan)、GAPDH基因表達RT-PCR檢測。各蛋白基因上下游引物見表2。椎間盤組織RNA提取采用Trizol試劑盒,提取組織RNA時,每50-100 mg組織用1 ml Trizol試劑對組織進行裂解;預變性94 ℃ 180 s;變性94 ℃ 10 s;退火58 ℃ 15 s;延伸72 ℃ 7 s。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 MRI %ST2WI值檢測結(jié)果

ADSC組和正常對照組%ST2WI值變化趨勢類似,兩者各時間點組間差異無統(tǒng)計學意義,提示二者均能有效地維持%ST2WI值;正常對照組、ADSC組在術(shù)后4,8,12周時%ST2WI值明顯高于DMEM組(P<0.05,見圖1)。提示ADSC組能有效維持髓核組織內(nèi)的含水量。

2.2 大體觀察

正常對照組纖維環(huán)完整有序,髓核組織為透明凝膠狀態(tài),椎體邊緣未見增生骨贅;ADSC組提示纖維環(huán)紋理維持良好,髓核組織狀態(tài)基本正常。DMEM組出現(xiàn)明顯退變,椎體邊緣出現(xiàn)骨贅,纖維環(huán)紋理紊亂,髓核組織變性,與椎間盤界限模糊(見圖2)。

與ADSC組相比,*P<0.05圖1 術(shù)后各個時間點%ST2WI值變化Figure 1 Changes of %ST2WI at different time points after operation

圖2 術(shù)后12周椎間盤矢狀面大體觀察Figure 2 General observation of sagittal plane of intervertebral disc 12 weeks after operation

2.3 組織切片染色結(jié)果及組織學評分

NC組HE染色和番紅O染色結(jié)果顯示髓核組織成橢圓形，可見較多細胞及細胞外基質(zhì)，邊界清晰完整，周圍纖維環(huán)層次分明，無明顯紊亂，髓核組織顯示均質(zhì)紅染，collagenⅡ免疫組化染色結(jié)果顯示髓核組織區(qū)域可見廣泛棕黃色collagenⅡ陽性表達，邊界清晰完整，周圍纖維環(huán)層次分明。

ADSC組HE染色和番紅O染色結(jié)果顯示髓核組織區(qū)域可見大量細胞團塊及明顯的細胞外基質(zhì)，髓核組織顯示均質(zhì)紅染，與纖維環(huán)邊界清晰，纖維環(huán)輕度紊亂，術(shù)后12周可見細胞團明顯增多，細胞外基質(zhì)明顯豐富，纖維環(huán)層次仍表現(xiàn)為輕度紊亂，collagenⅡ陽性表達，細胞外基質(zhì)豐富，纖維環(huán)顯示輕度紊亂。

DMEM組術(shù)后12周時HE染色和番紅O染色椎間盤顯示出髓核缺如或空洞，顯示出明顯的退變征象；collagenⅡ陽性表達較為局限(見圖3)。

圖3 術(shù)后12周椎間盤組織的HE染色、collagenⅡ和aggrecan免疫熒光染色結(jié)果 (×40, bar=300 μm)Figure 3 Results of HE staining, immunofluorescence staining of collagenⅡ and aggrecan in discs 12 weeks after operation (×40, bar=300 μm)

根據(jù)的組織學評分量表,各時間點椎間盤的退變程度的評分見表3。ADSC組和DMEM組退變分數(shù)明顯高于正常對照組(P<0.05);ADSC組退變分數(shù)明顯低于DMEM組(P<0.05);ADSC組與正常對照組之間比較差異沒有統(tǒng)計學意義。

2.4 real-time PCR測定結(jié)果

正常對照組collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達水平基本趨于穩(wěn)定。術(shù)后12周,real-time PCR檢測顯示DMEM組collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達明顯低于其他組(P<0.05);ADSC組和正常對照組collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達差異沒有無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4)。

表3 各組不同時間點退變分數(shù)的動態(tài)變化Table 3 Scales of degeneration at different time points after

與其他組相比有顯著差異,*P<0.05

與其他兩組比較，*P<0.05圖4 各組不同時間點collagen Ⅱ mRNA的相對水平Figure 4 Relative expression level of collagenⅡ mRNA at different time points in each group

與其他兩組比較，*P<0.05圖5 各組不同時間點aggrecan mRNA的相對表達水平Figure 5 Relative expression level of aggrecan mRNA at different time points in each group

3 討論

建立有效、可靠的IDD動物模型是研究IDD發(fā)生機制的基礎(chǔ),也為探討IDD的治療方式提供實驗模型[5]。能夠為研究其發(fā)病機制提供有利條件,也為治療IDD的各種探索研究提供良好的實驗載體,建立IDD模型的方式有很多,標準尚未達成統(tǒng)一。目前較為常用的模型均為誘發(fā)性退變,以直接干預損傷椎間盤結(jié)構(gòu)誘發(fā)退變應用最為廣泛[6]。

人類IDD的原因多與生活工作習慣相關(guān),而非損傷性退變過程。完全模擬人類椎間盤退變過程所用周期較長,故而實驗采用纖維環(huán)損傷建立模型的方式較為多見[7]。椎間盤退變模型的建立應當具有如下特點:能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律;具備高重復性、可靠性;盡可能與人類退變過程相似。本實驗通過空針穿刺抽吸出5-8 mg(濕重)的髓核組織,此方法對實驗動物椎間盤創(chuàng)傷小,使髓核組織喪失一定的體積,減少其含水量,髓核內(nèi)靜水壓下降,誘發(fā)其發(fā)生退變,此方法能更好地模擬IDD早期病程中的髓核生物學功能喪失的基本特征,可以作為針對細胞移植治療IDD的可靠動物模型。

ADSC是一種在組織工程領(lǐng)域應用非常廣泛的干細胞,而且ADSC的體外擴增效率也較穩(wěn)定,有足夠的細胞來源。本實驗中在采用穿刺抽吸法造模時同期進行ADSC的移植,觀察在椎間盤發(fā)生退變的早期ADSC對椎間盤退變的治療作用,盡管ADSC本身無法分泌類似髓核細胞的細胞外基質(zhì),但是ADSC的取材非常方便,人體內(nèi)具有豐富的脂肪組織,本實驗從兔腹股溝皮下獲取脂肪組織,并成功分離出易于體外培養(yǎng)、并能穩(wěn)定增殖的細胞。實驗結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的兔ADSC呈集落狀生長,傳代后的細胞生長速度明顯增快。和其他成體干細胞相比,脂肪組織來源充足,取材簡便。ADSC的增殖能力明顯強于髓核細胞并且在特定的環(huán)境下可以分化成為類軟骨細胞的表型[4]。本研究的實驗結(jié)果提示ADSC可以抑制椎間盤繼續(xù)發(fā)生退變。

在實驗周期方面,本實驗選取12周作為觀察的時間周期,借鑒了國外相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的觀察實效[8,9]。

在自然衰老的過程中,椎間盤高度的下降與髓核組織中蛋白多糖含水量的下降有關(guān)[10,11]。在臨床診斷IDD時,MRI T2加權(quán)像顯示的椎間盤信號強度是評價是否發(fā)生退變的重要參數(shù),MRI T2加權(quán)像的信號可以直接反映椎間盤組織內(nèi)的含水量,是較為敏感的評價指標,椎間盤內(nèi)髓核組織的修復也直接表現(xiàn)為蛋白聚糖及其含水量的恢復。術(shù)后12周DMEM組MRI顯示明顯的信號降低,表明髓核組織內(nèi)含水量顯著下降,退變程度較為嚴重。故而,單純使用DMEM培養(yǎng)基注射無法達到類似于種子細胞移植的修復效果,而ADSC組髓核組織信號輕微的降低,形態(tài)結(jié)構(gòu)仍然相對完整。上述觀察到的影像學改變表明,通過ADSC的早期移植的技術(shù)可以抑制椎間盤退行性變。

為了進一步觀察ADSC對IDD的修復效果,本實驗還進行了組織學染色和免疫組化染色。HE染色結(jié)果可以顯示出椎間盤清晰的結(jié)構(gòu),ADSC組在椎間盤結(jié)構(gòu)完整性方面強于DMEM組。由于HE染色無法顯示出髓核組織的內(nèi)部蛋白成分,所以我們又進行了番紅O染色和免疫組化染色,collagen Ⅱ和aggrecan是ADSC的主要細胞外基質(zhì),aggrecan免疫熒光染色和番紅O染色均顯示髓核組織中aggrecan的蛋白表達情況。免疫組化染色顯示在ADSCs組中髓核組織呈現(xiàn)廣泛的陽性,而DMEM組隨著時間的推移陽性表現(xiàn)進行性減弱,12周后表現(xiàn)為陰性反應,表明椎間盤已發(fā)生嚴重退變。real-time PCR在基因水平檢測了collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表達水平,其結(jié)果與免疫組化染色一致,說明ADSC很好地抑制了髓核組織的繼續(xù)退變。

我們在細胞移植過程中使用的是29G胰島素注射器,可以滿足細胞移植的需要而不使纖維環(huán)產(chǎn)生二次破壞[12],相反,如果纖維環(huán)被二次破壞后,將會有血管神經(jīng)長入椎間盤內(nèi)部,進而種子細胞將暴露于血液而產(chǎn)生免疫反應,最終影響其修復效果[13]。我們認為外源性地補充ADSC對椎間盤內(nèi)殘余髓核細胞進行影響,或者椎間盤的內(nèi)環(huán)境可以滿足ADSC的增殖分泌相應的細胞外基質(zhì)[14]。本實驗主要目的在于觀察椎間盤早期的退變情況,在造模的早期進行干預操作,此時纖維環(huán)和髓核組織受到穿刺抽吸刺激后剛剛開始發(fā)生退變,此時是選擇干預的最佳時機,同時避免了對實驗動物的二次手術(shù)。

本實驗的不足之處是缺乏生物力學的檢測指標,對于各個時間點椎間盤的活動功能沒有明確的數(shù)據(jù)支持,在組織工程各種常用的干細胞中,對椎間盤的退變抑制作用之間的差異,這將是實驗下一步進行的主要方向。