應(yīng)用血清PIVKA-II診斷肝細胞癌研究進展*

邢 昊，韓 駿 綜述，楊 田 審校

原發(fā)性肝癌（PLC）可大致分為肝細胞癌（HCC）和肝內(nèi)膽管細胞癌（CC），兩者分別起源于肝細胞或者肝內(nèi)膽管上皮細胞。作為最常見的惡性腫瘤之一，PLC死亡率高居全球腫瘤死亡率第二位。而在全球范圍來看，近50%的PLC新發(fā)及死亡病例發(fā)生在中國[1]。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，原發(fā)性肝癌在中國癌癥相關(guān)死亡率的排例中位列第四位，發(fā)病例數(shù)約為46.61萬例[2]。有調(diào)查顯示，中國癌癥患者的5年相對生存率約為30.9%，而肝癌患者僅為10.1%，在所有種類的惡性腫瘤中，肝癌預后最差[3]。究其原因是因為大多數(shù)肝癌患者在臨床確診時已處于晚期，失去了接受根治性治療的機會。因此，早期診斷能夠大大延長PLC患者的存活時間。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的肝癌診斷腫瘤標志物；但另一方面，因其敏感度、特異度較差，所以對PLC的早期診斷價值有限[4]。最新美國肝病研究學會（AASLD）、歐洲肝病學會（EASL）的臨床推薦指南[5，6]，已經(jīng)將肝癌血清標志物，如AFP、AFP-L3和維生素K缺乏或拮抗劑II誘導的蛋白（protein induced by vitamin K absence or antagonist（IIPIVKA-II）的定期檢測去除，而將超聲檢查作為肝癌高危人群唯一的篩查及監(jiān)測手段。然而，超聲檢查的診斷能力有較大的局限性，依賴于操作者個人操作水平以及超聲設(shè)備，單一的超聲檢查很難完全滿足臨床對于肝癌監(jiān)測及診斷的需求。日本等發(fā)達國家已將PIVKA-II應(yīng)用于HCC（多由丙型肝炎病毒感染引起）常規(guī)篩查和早期診斷，有報道指出其診斷HCC的特異性為84%，敏感性為72%[7]。PIVKA-II作為近年來研究較多的一種HCC腫瘤標志物，并且與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，本文就PIVKA-II在HCC中的應(yīng)用進行綜述。

Liebman最早于1984年報道了將PIVKA-II作為PLC的血清學標志物[8]。近年來其在肝癌診斷中逐漸成為研究熱點。在生理條件中，凝血酶原前體在肝細胞內(nèi)經(jīng)γ-谷氨酰羧化酶的作用下，其上的谷氨酸殘基羧化為γ-羧基谷氨酸，轉(zhuǎn)化為正常的凝血酶原。而PIVKA-II的特點是其結(jié)構(gòu)中一個或多個谷氨酸殘基不完全羧化為γ-羧基谷氨酸，因此PIVKA-II是一種失去了正常凝血酶原功能的異常凝血酶原。而γ-谷氨酰羧化酶的作用需要維生素K的輔助，因此在維生素K缺乏和服用華法林的人群可檢測出PIVKA-II[9，10]。

1 PIVKA-II的生物學功能

目前已有的大量臨床研究證實：PIVKA-II可作為肝癌的篩查以及預后判斷指標。然而PIVKA-II在肝癌組織中過表達、以及腫瘤增殖為何與PIVKA-II的過表達有關(guān)，其機制目前尚未完全闡明，已有的基礎(chǔ)研究結(jié)果有助于研究者更好地理解PIVKA-II在肝癌發(fā)生及發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

2.1 PIVKA-II對肝癌細胞的增殖作用 PIVKA-II的結(jié)構(gòu)中包含兩個環(huán)形結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與肝細胞生長因子相似[11]。在肝細胞生長因子（HGF）中，環(huán)形結(jié)構(gòu)域有助于HGF與受體（Met）的穩(wěn)定結(jié)合，從而誘導細胞增殖。PIVKA-II促進細胞尤其是肝癌細胞增殖的機制可能是其與Met結(jié)合，激活下游通路，從而誘導增殖。Suzuki et al研究發(fā)現(xiàn)，在添加了純化PIVKA-II的肝癌細胞系中，DNA合成水平明顯提高。且這種現(xiàn)象在無PIVKA-II生成的細胞系中更為明顯，這些結(jié)果均提示了PIVKA-II可誘導肝癌細胞的增生。更進一步的研究顯示，PIVKA-II與Met結(jié)合之后，激活Met-Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子-3通路，誘導HCC細胞增殖[12]。以上結(jié)果均提示了PIVKA-II促增殖的作用機制可能與HGF相似。研究者通過改變PIVKA-II的分泌量進而分析PIVKA-II對肝癌細胞增殖的影響，注射維生素K2，顯著降低了在肝癌細胞系中PIVKA-II的表達量，從而評估PIVKA-II的降低對肝癌細胞系的改變。實驗數(shù)據(jù)顯示，PIVKA-II表達的下降降低了肝癌細胞系的惡性程度，維生素K2以劑量依賴方式抑制了HCC細胞系的生長。分析發(fā)現(xiàn)在裸鼠的體內(nèi)注射維生素K2可顯著降低腫瘤異體移植后的重量以及血清PIVKA-II水平，同時未觀察到明顯的急性或遲發(fā)毒性作用。該研究結(jié)果顯示通過控制PIVKA-II的水平或許可以抑制癌癥進展，證明了PIVKA-II與腫瘤的生物學行為存在著聯(lián)系[13]。

2.2 PIVKA-II對肝癌細胞的成血管作用 PIVKA-II可提高肝癌組織周圍的成血管作用，這是PIVKA-II在肝癌中的另一個生物學效應(yīng)。Fujikawa利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）分析PIVKA-II的成血管作用，結(jié)果顯示PIVKA-II可促進DNA合成以及HUVEC的遷移，而正常凝血酶原無此類效應(yīng)。進一步研究顯示，PIVKA-II通過與激酶插入域受體（KDR）相結(jié)合，激活KDR-PLC-MAPK信號通路，繼而促進DNA合成和細胞遷移[14]。其他研究也得出了類似結(jié)果。PIVKA-II誘導了EGFR和VEGF在HUVEC細胞中的過表達[15，16]。以上研究結(jié)果均提示了肝癌組織分泌的PIVKA-II可誘導肝癌周圍組織的血管生成，進而影響患者的預后。高富軍等人研究發(fā)現(xiàn)PIVKA-II可以促進肝癌細胞中多種血管生成因子的表達，包括VEGF、TGF-β、bFGF。血管生成是腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中不可或缺的現(xiàn)象，同時與較差的腫瘤行為緊密聯(lián)系，高微血管密度可能導致肝癌的復發(fā)。因此，PIVKA-II在腫瘤進程中通過誘導血管生成發(fā)揮了重要作用，這些研究均有助于理解PIVKA-II是如何促進肝癌進展[17]。

2 PIVKA-II診斷HCC的價值

肝癌高危人群包括有肝腫瘤家族史、AFP持續(xù)低濃度陽性或肝功能異常的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性、有肝硬化表現(xiàn)等人群[18]。目前，最為常用HCC的監(jiān)測方法是血清AFP和超聲檢查。根據(jù)HCC發(fā)生、發(fā)展的速度，指南推薦的監(jiān)測周期為6個月[19]。AFP是應(yīng)用最為普遍的肝癌血清標志物，然而其仍然存在以下不足：慢性肝病患者尤其是肝細胞再生活躍者，在未出現(xiàn)惡變情況下，血清AFP常常也會升高；對于肝癌診斷AFP的敏感度很低，據(jù)報道僅1/3的HCC患者血清AFP升高超過100 ng/ml；在小肝癌中，甲胎蛋白常表現(xiàn)為正常水平。

1984 年，Liebman et al報道在76例HCC患者中有69例患者體內(nèi)表達高水平PIVKA-II[8]。同時他們發(fā)現(xiàn)在28例慢性活動性肝炎病人中，僅3例病人PIVKA-II水平升高。目前，40 mAU/ml是PIVKA-II最為常用的臨界值，在這一臨界值下，小肝癌的早期診斷率得以提高[20]。AFP和PIVKA-II的形成機制互不相同，兩者之間無相關(guān)性。因此，將AFP以及PIVKA-II聯(lián)合應(yīng)用可提高對HCC的檢出率和準確性[21]。PIVKA-II診斷的特異性優(yōu)于AFP，僅5%的非惡性肝病病人會出現(xiàn)超過100 ng/ml的PIVKA-II水平升高。而在腫瘤直徑較大的HCC，PIVKA-II的表達水平與腫瘤大小相關(guān)，有研究報道在小于3cm的HCC患者中，僅20%患者PIVKA-II水平出現(xiàn)升高[22]。根據(jù)Nakamura et al的報道，PIVKA-II在小肝癌中的診斷能力（即敏感度和特異度）低于AFP，在較大的肝癌診斷中情況則相反，PIVKA-II的診斷能力要高于AFP[23]。在Baek et al研究中評價了PIVKA-II水平與HCC分期的相關(guān)性。該研究表明，PIVKA-II在檢測大于5cm，3-5cm和小于3cm的HCC患者中，陽性率均高于AFP（分別為96，83，74%vs 65，57，48%）[24]。高春芳等報道了 PIVKA-II在以乙型肝炎相關(guān)性HCC為主中國人群中的應(yīng)用價值，研究結(jié)果顯示PIVKA-II以臨界值40 mAu/ml檢測肝癌，診斷敏感度和特異度分別為82.6%和89.1%，均高于AFP（敏感度：67.8%，特異度91.2%），且PIVKA-II的受試者工作曲線下面積顯著高于AFP。PIVKA-II在診斷早期HCC以及AFP表達陰性的HCC中也顯示出優(yōu)勢，而PIVKA-II數(shù)值與腫瘤包膜、腫瘤大小和數(shù)目以及TNM腫瘤分期等腫瘤進展參數(shù)顯著相關(guān)[25]。綜上所述，PIVKA-II在肝癌的診斷包括早期診斷中具有獨特的優(yōu)勢，診斷能力顯著優(yōu)于臨床上最常用的診斷指標AFP。同時PIVKA-II能夠更好的反應(yīng)腫瘤的進展程度，進一步支持了其作為HCC診斷標志物的臨床價值。

3 PIVKA-II在判斷HCC患者預后的價值

對于HCC患者來說，理想的術(shù)后結(jié)果為患者實現(xiàn)長期的生存同時無HCC的復發(fā)。然而，絕大多數(shù)患者在確診的時候已處于晚期，這類患者的治療往往效果較差，預后不佳。Yamarnato et al對AFP和PIVKA-II在HCC診斷中的作用進行研究，對714例肝切除術(shù)患者進行回顧性隊列研究。計算了這些標志物的靈敏度和特異度，評估根治性手術(shù)切除后標志物的反應(yīng)變化，研究標志物水平與預后變量之間的相關(guān)性，以及手術(shù)前和復發(fā)后的標志物水平的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示AFP和PIVKA-II的ROC面積分別是0.79和0.91（P＜0.001）。術(shù)后6個月分別有184/229（80.3%）的患者和245/246（99.6%）的患者從AFP和PIVKA-II陽性轉(zhuǎn)化為陰性（AFP臨界值為20 ng/mL，PIVKA-II臨界值為 40 mAU/mL，P＜0.0001），標志物水平之間無相關(guān)性（γ=0.23）。而PIVKA-II水平與腫瘤大小密切相關(guān)，AFP與腫瘤大小則無相關(guān)性（γ分別為0.51和0.19）。術(shù)后≤6個月復發(fā)患者的AFP和PIVKA-II水平與術(shù)前測定的水平相關(guān)（γ=0.78和0.49）；但在術(shù)后2年復發(fā)的患者中，未發(fā)現(xiàn)這一相關(guān)性（γ=0.31和0.30）。研究者認為，在診斷HCC時，PIVKA-II比測定AFP更為準確。盡管在腫瘤進展時，兩種指標均有上升，但二者之間并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性[26]。

此外多項研究均指出，高PIVKA-II水平與HCC的侵襲性和轉(zhuǎn)移性有關(guān)[27]。Pote et al研究者對85例HCC和43例肝硬化患者進行對比研究，PIVKA-II不僅在早期HCC的診斷上較AFP有優(yōu)勢，單因素和多因素分析結(jié)果均提示PIVKA-II水平是微血管侵犯（MVI）的獨立危險因素（HR：3.5，P＜0.043），而MVI則是一項明確的HCC復發(fā)和死亡相關(guān)因素[27]。在另一項納入218例行肝切除術(shù)病人的研究中，Shirabem報道了術(shù)前PIVKA-II水平、腫瘤直徑和組織分化程度與出現(xiàn)MVI顯著相關(guān)[28]。Shimada研究證實了上述結(jié)論，研究納入了40例患者（受試者均接受了活體肝臟移植術(shù)），研究結(jié)果顯示PIVKA-II水平＞300mAU/ml與MVI相關(guān)[29]。這些研究均提示了PIVKA-II水平高提示較差預后。在腫瘤預后評價方面，Kim do et al研究發(fā)現(xiàn)，血清PIVKA-II水平和腫瘤復發(fā)相關(guān)，即使在直徑≤3 cm的小肝癌患者中，血清PIVKA-II水平的升高仍然發(fā)生在腫瘤組織血管浸潤之前。晚期肝癌門靜脈侵犯的病人，其血清PIVKA-II水平明顯升高[30]。小肝癌往往預后較好，因此，理想的HCC腫瘤標志物應(yīng)當在小肝癌也能夠有尚佳的表現(xiàn)。Kim et al研究者對180例HCC患者進行回顧性研究，患者的腫瘤大小均小于2厘米，多因素分析結(jié)果顯示PIVKA-II≥200 mAu/ml是腫瘤復發(fā)的獨立危險因素（OR=3.619，P=0.016）[31]。綜上所述，PIVKA-II是一種有預后判斷價值的腫瘤標志物，不僅可以較準確地預測腫瘤進展情況，還可為評估患者的預后提供相關(guān)依據(jù)，從而指導臨床醫(yī)生選擇個體化的治療方式。

4 聯(lián)合應(yīng)用PIVKA-II與其他腫瘤標志物的臨床診斷價值

到目前為止，AFP是最常用于檢測HCC的腫瘤標志物，但是由于特異度、靈敏度較差，其對肝癌的早期診斷價值有限。因此尋找有效的肝癌腫瘤標志物仍然是研究人員努力的方向，通過多種HCC標志物的聯(lián)合應(yīng)用有望提高診斷能力[32，33]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤標志物在HCC中會升高，包括甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）、上皮特異性細胞黏附分子（EpCAM）、異常凝血酶原（PIVKA-II）、α-L-巖藻糖苷酶（AFU）等，這些血清標志物既有自身獨到的診斷價值，也存在局限性[34]。多項研究發(fā)現(xiàn)，血清PIVKA-II同其他腫瘤標志物聯(lián)合應(yīng)用對于HCC診斷以及監(jiān)測治療療效均具有比較高的臨床應(yīng)用價值。Hidenori T研究173例病人原發(fā)性肝癌肝切除術(shù)手術(shù)前后體內(nèi)腫瘤標志物的變化情況，3種腫瘤標志物分別為DCP、AFP、AFP-L3。研究顯示，術(shù)后3種指標升高情況與病人生存率及腫瘤復發(fā)率相關(guān)，術(shù)后升高的指標數(shù)目越多，復發(fā)率相應(yīng)升高，同時生存率也相應(yīng)降低[35]。Young EC根據(jù)術(shù)前乙型肝炎相關(guān)性肝癌病人的DCP和AFP水平，將其分為I組（AFP＞20 ng/dL且DCP＞40 mAU/m）和II組（AFP＞20 ng/dL 且 DCP＜40 mAU/mL；AFP＜20 ng/dL 且 DCP40 mAU/mL；AFP＜20 ng/dL 且 DCP＜40 mAU/mL）, 根治性切除術(shù)后隨訪結(jié)果顯示：I組是術(shù)后復發(fā)的顯著預測指標。與II組相比，I組的無病生存率明顯縮短，因此該研究者認為，DCP與AFP的聯(lián)合應(yīng)用可能是判斷復發(fā)的預后指標[36]。Lee研究顯示，在接受動脈化療栓塞的初治肝癌病人中，AFP對治療的反應(yīng)性和PIVKA-II基線值可作為判斷總生存率的預測指標[37]。有類似研究證實高PIVKA-II基線值與不良預后及高復發(fā)風險顯著相關(guān)，盡管高PIVKA-II基線值是如何影響預后尚未完全明確，研究者認為部分原因是由于高基線值與腫瘤的血管侵犯、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤高復發(fā)率顯著相關(guān)。另有研究者對79例HCC和77例肝硬化患者血清中AFP、PIVKA-II和AFP-L3同時進行檢測，結(jié)果顯示：當PIVKA-II＞40 mAU/mL和AFP＞10 ng/mL 時，這種診斷標志物的組合AUC最大（0.765），AFP與PIVKA-II結(jié)合使用可以提高診斷能力，但結(jié)合AFP-L3并不能顯著提高這種組合的診斷效能[38]。

5 結(jié)語與展望

綜上所述，PIVKA-II在肝癌診斷及預后判斷方面有著良好的臨床應(yīng)用前景，而PIVKA-II與AFP、AFP-L3等這些腫瘤標志物的聯(lián)合檢測有助于提升肝癌早期診斷效率，從而實現(xiàn)早期診斷、早期治療，極大的改善預后。PIVKA-II在肝癌發(fā)生及發(fā)展的過程中所起到的確切作用，PIVKA-II的產(chǎn)生機制，以及PIVKA-II應(yīng)用于肝癌高危人群的監(jiān)測，這些均是未來研究者的研究方向。