藿香正氣水調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群失調(diào)的作用研究

1.四川省甘孜藏族自治州人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 四川 康定 62600;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 61105

人腸道菌群數(shù)量龐大，正常情況下，腸道菌群和宿主、外界環(huán)境建立起一個動態(tài)的生態(tài)平衡，對人體的健康起著重要作用，任何打破其內(nèi)外環(huán)境的舉措都可導(dǎo)致菌群失調(diào)，表現(xiàn)為腸道菌群的種類、數(shù)量、比例、定位和代謝特征的變化[1]。機(jī)體內(nèi)的菌群生態(tài)平衡遭到破壞后可引起二重感染或重疊感染，使機(jī)體的生態(tài)平衡遭到嚴(yán)重破壞，從而引發(fā)腹瀉、腹脹等臨床癥狀。臨床上菌群失調(diào)多見于大劑量使用抗生素和慢性消耗性疾病，部分中藥及中成藥具有扶植正常菌群生產(chǎn)的作用，可調(diào)節(jié)菌群失調(diào)，從而達(dá)到治療或改善臨床癥狀的作用[2-5]。本院有大量采用藿香正氣水治療菌群失調(diào)型腹瀉的臨床案例，為探討其作用機(jī)制，筆者設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以觀察其對菌群失調(diào)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g。由四川省中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2013-19，飼養(yǎng)溫度18～22℃，相對濕度58%～62%，喂食顆粒標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水和攝食，每2天更換1次墊料，正常飼養(yǎng)3d后供試，實(shí)驗(yàn)前小鼠飲水、進(jìn)食正常，狀態(tài)良好。

1.2 藥品與試劑 乳酶生片(批號160408，桂林南藥股份有限公司)；鹽酸林可霉素針劑(批號160611，天津金耀氨基酸有限公司)；藿香正氣水(160607，太極集團(tuán)有限公司)；Anaero Gen 2.5 litre(英國Oxoid)；瓊脂粉、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；L-半胱氨酸(上海伯奧生物科技有限公司)；伊紅美蘭培養(yǎng)基(EMB)、改良MRS培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基；其余試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 鹽酸林可霉素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)模型的建立[6-8]造模前對小鼠禁食不禁水12 h，然后灌胃0.30 g/mL鹽酸林可霉素，0.6 mL/次(小鼠每克體重給藥7.2 mg)，2次/d，連續(xù)5d，造成小鼠菌群失調(diào)。正常對照組給予同體積的生理鹽水。于末次給藥12 h后取小鼠新鮮糞便進(jìn)行細(xì)菌數(shù)檢測，觀察造模情況。與正常對照組比較，若球菌和桿菌數(shù)量變化顯著，則認(rèn)為造模成功。

2.2 分組及處理 取造模成功的小鼠50只隨機(jī)分為藿香正氣水高劑量組、藿香正氣水中劑量組、藿香正氣水低劑量組、乳酶生組和模型組，每組10只，分別給予灌胃 3.0 mL·kg-1、1.5 mL·kg-1、0.75 mL·kg-1的藿香正氣水溶液，0.132 mg·g-1乳酶生片，均用生理鹽水補(bǔ)足到相同給藥體積(0.2 mL/20 g)，2次/d，連續(xù)給藥7 d。模型對照組、正常對照組小鼠灌胃同體積的生理鹽水。于末次給藥12 h后取小鼠的新鮮糞便進(jìn)行細(xì)菌數(shù)檢測。

2.3 糞便的菌群檢測[8]于末次給藥12 h后通過按壓小鼠腹部的方式迫使小鼠排便，收集約1 g的新鮮糞便，置帶有玻璃珠的無菌小瓶中，以1∶10(W/V)比例加入無菌生理鹽水，震蕩均勻，作為第一稀釋濃度。然后用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋至10-7。選用10-6、10-7兩個濃度的供試液，取10 μL均勻涂布于EMB、EC、MRS、MC平板上。EMB、EC于37℃需氧培養(yǎng)24h，MRS、MC厭氧培養(yǎng)48～72h后觀察結(jié)果。根據(jù)菌落特征以及革蘭氏染色結(jié)果初步鑒定菌種，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。結(jié)果以每克糞便中菌落數(shù)的對數(shù)表示(lgCFU·g-1)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠腸道菌群失調(diào)模型建立 小鼠連續(xù)給予鹽酸林可霉素3 d后，開始出現(xiàn)腹瀉、精神萎靡、扎堆等現(xiàn)象，連續(xù)給藥5 d后，收集小鼠新鮮糞便，檢測其細(xì)菌變化。由表1可知，模型組小鼠腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌的含量均降低，與正常對照組比較，腸球菌、雙歧桿菌含量減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腸桿菌、乳酸菌含量明顯減低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 小鼠腸道菌群失調(diào)模型建立后小鼠糞便的細(xì)菌含量變化

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，**P<0.01。

3.2 藿香正氣水對腸道菌群失調(diào)模型小鼠細(xì)菌含量的影響 菌群失調(diào)模型小鼠通過乳酶生和不同劑量藿香正氣水處理后，其腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量均顯著上升，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由表2可知，灌胃鹽酸林可霉素可制造穩(wěn)定的菌群失調(diào)小鼠模型，造模成功后，模型組小鼠給予生理鹽水治療，其腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌的含量分別為(7.48±0.35) lgCFU·g-1、(8.27±0.37) lgCFU·g-1、(8.14±0.28) lgCFU·g-1、(7.22±0.27) lgCFU·g-1，與正常對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，尤其是腸桿菌和乳桿菌(P<0.01)。藿香正氣水能顯著升高腸道菌群失調(diào)模型小鼠糞便中腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌的含量。藿香正氣水低劑量組(0.75 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量均有所升高，但除乳桿菌外，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。藿香正氣水中劑量組(1.5 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，乳桿菌含量升高最為明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。藿香正氣水高劑量組(3.0 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 小鼠糞便標(biāo)本的菌群檢測結(jié)果

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，**P<0.01。

4 討論

目前抗菌藥物是最常見引起腸道菌群失調(diào)的誘因，抗菌藥物使用后將腸道內(nèi)敏感細(xì)菌大量殺死，各菌種間的比例發(fā)生較大幅度的變化而超出正常范圍的狀態(tài)，特別是原籍菌的數(shù)量和密度下降，而外籍菌的數(shù)量和密度升高?？咕幬锼碌哪c道菌群失調(diào)的主要臨床癥狀為腹瀉，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鹽酸林可霉素灌胃造模后小鼠新鮮糞便的菌落數(shù)量和種類均明顯下降，且給藥3 d開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，隨后出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振等癥狀，表明通過此法所制作的腸道菌群失調(diào)小鼠模型是可靠的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信[9-10]。

多數(shù)細(xì)菌在同一環(huán)境中生存，相互間會形成生物拮抗，避免某一種細(xì)菌(特別是致病菌或條件致病菌)成為優(yōu)勢菌，最終對機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)，如：嘔吐、腹瀉等臨床癥狀[7]。藿香正氣水主要由藿香、蒼術(shù)、陳皮、厚樸、白芷、茯苓、半夏、甘草、紫蘇等多味中藥組成，具有散寒化濕、和中祛暑的作用，常用于治療脘腹脹痛、嘔吐腹瀉以及胃腸感冒等。在臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)其對腸道菌群失調(diào)型腹瀉亦具有良好療效，為發(fā)掘其治病機(jī)理，遂設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，以期能初步揭示其治療腸道菌群失調(diào)型腹瀉的方式以及物質(zhì)基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，藿香正氣水中、高劑量組均能顯著改善鹽酸林可霉素所致的腸道菌群失調(diào)癥狀，扶植腸道菌群，恢復(fù)腸道健康，表明藿香正氣水具有一定調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的作用。