白熱斯丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

姜萌，李治建，張雨欣，霍仕霞*，斯拉甫 艾白，閆明*，張?zhí)m蘭

1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830002

民族醫(yī)藥學(xué)在長期的發(fā)展過程中用民族藥治療白癜風(fēng)積累了豐富的實踐經(jīng)驗[1]。白熱斯丸是由驅(qū)蟲斑鳩菊、玫瑰花瓣、干姜、蓽茇、盒果藤、蒺藜六味中藥采用傳統(tǒng)制藥工藝和現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)的口服固體藥丸。該制劑具有驅(qū)寒止痛、化瘀消腫、殺蟲去斑的功效，能有效地激活酪氨酸酶的活性、促進(jìn)黑色素的形成、增加皮膚的光敏作用，有改善病灶部位皮膚的微循環(huán)環(huán)境和補(bǔ)充微量元素的功能[2-4]，該制劑現(xiàn)主要用于白癜風(fēng)的治療。為保證白熱斯丸的安全、穩(wěn)定，對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下的鑒別、檢查、含量測定內(nèi)容進(jìn)行研究，并初步建立白熱斯丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 儀器

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD)；SQP電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；WD-9403A型雙光觀察照相儀(北京沃德生物儀器公司)；WG1-070超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；FCB-500A型萬能高速粉碎機(jī)(上海菲力博食品機(jī)械有限公司)；UPS-Ⅰ- 40L優(yōu)普系列超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；BJ-2D智能崩解試驗儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造有限公司)。

1.2 試藥

槲皮素對照品(批號：10081-201610，純度：98.3%)、胡椒堿對照品(批號：110775-201405，純度：98.9%)均由中國食品藥品檢定研究院提供；驅(qū)蟲斑鳩菊(產(chǎn)地：新疆，批號：201701003)、干姜(產(chǎn)地：云南，批號：201610003)、蓽茇(產(chǎn)地：廣西，批號：201609003)、玫瑰花瓣(產(chǎn)地：新疆，批號：201610003)、盒果藤(產(chǎn)地：新疆，批號：201701003)均購自北京時珍堂(宜昌)藥業(yè)有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

白熱斯丸樣品為自制(批號分別為：20170812、20170814、20170816、20170818、20170820、20170822、20170824、20180215、20180216、20180217)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 槲皮素的TLC鑒別 取10批白熱斯丸粉末，每份1 g，加50 mL甲醇，超聲0.5 h，濾過，濾液蒸干，加水30 mL溶解，水液加HCL 5 mL，置80 ℃水浴中水解1 h，取出迅速冷卻，用乙醚萃取2次每次20 mL，合并乙醚液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙醚液揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含4 mg的溶液，即得槲皮素對照品溶液。根據(jù)處方取缺玫瑰花瓣的其他各味藥材，按法制成丸劑，取丸劑適量，照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

照薄層色譜法實驗，吸取上述供試品溶液、缺玫瑰花瓣的陰性樣品溶液各10 μL及對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出吹干，置紫外燈(365 nm)下檢視[5]。結(jié)果見圖1。

注：a.槲皮素對照；b.陰性對照溶液；c～l.10批白熱斯藥丸樣品。圖1 槲皮素薄層鑒別

2.1.2胡椒堿的薄層鑒別 取10批白熱斯丸粉末，每份1 g，加5 mL無水乙醇，超聲0.5 h，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取胡椒堿對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含4 mg的溶液，作為胡椒堿對照品溶液。根據(jù)處方取缺蓽茇的其他各味藥材，按制備工藝制成丸劑，照供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

照薄層色譜法實驗，吸取白熱斯丸供試品溶液、缺蓽茇丸劑的陰性樣品溶液各10 μL及胡椒堿對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(5∶4.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視[6]。結(jié)果見圖2。

注a.胡椒堿對照；b.陰性對照溶液；c～l.10批白熱斯藥丸樣品。圖2 胡椒堿薄層鑒別

2.2 水分檢查

將丸劑粉碎，過60目藥篩，取供試品2～5 g，平鋪至扁形稱量瓶中，扁形稱量瓶事先干燥至恒質(zhì)量，厚度不超過5 mm，精密稱定，打開瓶蓋干燥5 h，干燥溫度105 ℃，蓋好瓶蓋，移置干燥器中，放冷0.5 h，精密稱定，繼續(xù)105 ℃干燥1 h，放冷后稱質(zhì)量，至連續(xù)兩次稱質(zhì)量的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的質(zhì)量，計算供試品中含水量(%)[12]。結(jié)果顯示，10批白熱斯丸中含水量分別為8.49、8.58、8.48、8.59、8.47、8.46、8.40、8.40、8.59、8.51，均未超過9.0%，白熱斯丸含水量符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 含量測定

2.3.1 槲皮素含量測定

2.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.2%磷酸水(56∶44)，流速：1 mL min-1，進(jìn)樣量：10 μL，檢測波長：367 nm，柱溫：30 ℃。

2.3.1.2 對照品溶液的配制 取適量槲皮素對照品，精密稱定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg槲皮素的溶液，即對照品儲備液。精密吸取0.1 mL對照品儲備液，置10 mL棕量瓶，用甲醇定容至刻度線，即得質(zhì)量濃度為20 μg mL-1的對照品溶液。

2.3.1.3 供試品溶液的制備 取白熱斯丸粉末，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加20 mL甲醇、50%鹽酸5 mL，80 ℃水浴水解50 min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻并濾過，續(xù)濾液即供試品溶液。

2.3.1.4 陰性對照品溶液的制備 取處方缺玫瑰花的其他各味藥材，按制備工藝制成丸劑，取丸劑適量，照2.3.1.3項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3.1.5 專屬性 精密吸取對照品溶液20 μL、供試品溶液20 μL、陰性樣品溶液20 μL，照2.3.1.1項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在槲皮素相應(yīng)的保留時間未出現(xiàn)色譜峰，表明在該色譜條件下槲皮素和胡椒堿的吸收良好，基線無干擾，白熱斯丸中其他成分對槲皮素測定無干擾。

注：A.陰性樣品溶液；B.槲皮素對照品；C.供試品溶液。圖3 槲皮素HPLC圖

2.3.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1對照品系列液。按照2.3.1.1項下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=51 536X-112 070，r=0.999 5，說明槲皮素質(zhì)量濃度在6.25～200 μg mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.1.7 精密度試驗 取同一份樣品溶液，按照2.3.1.1項色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果槲皮素的峰面積RSD為0.13%，表示方法精密度良好[7]。

2.3.1.8 重復(fù)性試驗 取同一批號(20170812)的白熱斯丸各6份，按2.3.1.3項下方法制備白熱斯供試品溶液，對槲皮素進(jìn)行含量測定，峰面積RSD為0.05%，表示方法重復(fù)性良好[8-9]。

2.3.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一白熱斯丸(20170812)供試品溶液，分別于1、2、4、6、8、12、24 h分別按照2.3.1.1項色譜條件進(jìn)樣，測定槲皮素的峰面積。計算得槲皮素RSD為0.13%(n=7)，說明白熱斯丸供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[10-11]。

2.3.1.10 加樣回收率 分別稱取約0.25 g已知含量的白熱斯藥丸(20170812)粉末9 份，精密稱定，再分別按照高、中、低濃度，精密加入一定量槲皮素對照品，混合均勻，按2.3.1.3項下方法處理后，按2.3.1.1項色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，白熱斯丸中槲皮素平均加樣回收率為95.7%，RSD=2.77%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

2.3.1.11 樣品含量測定 精密稱取10批白熱斯藥丸，照2.3.1.3項下方法制備，并照2.3.1.1項色譜條件進(jìn)行測定，同時計算槲皮素含量，結(jié)果見表1。

表1 白熱斯丸中槲皮素含量測定結(jié)果 mg g-1

2.3.2胡椒堿含量測定

2.3.2.1 色譜條件 色譜柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相∶甲醇-水(77∶23)，流速：1 mL min-1，檢測波長：343 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2.2 對照品溶液的配制 取適量胡椒堿對照品，精密稱定，置棕量瓶，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，即對照品儲備液。精密吸取0.1 mL對照品儲備液，置10 mL棕量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得質(zhì)量濃度為20 μg mL-1的對照品溶液。

2.3.2.3 供試品溶液的制備 取0.1 g白熱斯丸粉末，精密稱定，置棕量瓶，加25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲0.5 h，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量。搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2.4 陰性對照品溶液的制備 根據(jù)處方取缺蓽茇的其他各味藥材，按法制丸劑，取丸劑適量，照2.3.2.3項下方法制成陰性對照品溶液。

2.3.2.5 專屬性 精密吸取對照品溶液20 μL、供試品溶液20 μL、陰性樣品溶液20 μL，照2.3.2.1項色譜條件測定。結(jié)果顯示，陰性樣品溶液在胡椒堿相應(yīng)的保留時間未出現(xiàn)色譜峰，表明在該色譜條件下胡椒堿的吸收良好，基線無干擾，白熱斯丸中其他成分對胡椒堿測定無干擾。

注：A.陰性樣品溶液；B.胡椒堿對照品；C.供試品溶液。圖4 胡椒堿HPLC圖

2.3.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液適量，逐級稀釋制成200、100、50、25、12.5、6.25 μg mL-1對照品系列液。按照2.3.2.1項色譜條件進(jìn)行高效液相色譜法測定，以峰面積(Y)對進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=78 378X-30 138，r=0.999 9，表明胡椒堿質(zhì)量濃度在6.25～200 μg mL-1線性關(guān)系良好。

2.3.2.7 精密度試驗 取同一份樣品溶液，按照2.3.2.1項色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果胡椒堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.212 mg g-1，RSD為0.000 4%，表示方法精密度良好。

2.3.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號(20170812)的白熱斯丸6份，按2.3.2.3項下方法制備白熱斯供試品溶液，對胡椒堿進(jìn)行含量測定，胡椒堿峰面積RSD為0.12%，表示方法重復(fù)性良好。

2.3.2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一白熱斯丸(20170812)供試品溶液，于1、2、4、6、8、12、24 h分別按照2.3.2.1項色譜條件進(jìn)樣，測定胡椒堿的峰面積。計算得胡椒堿RSD為0.000 9%(n=7)，說明白熱斯丸供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.2.10 加樣回收率 分別稱取約0.05 g已知含量的白熱斯(20170812)藥丸粉末9份，精密稱定，再分別按照高、中、低濃度精密加入一定量胡椒堿對照品，混合均勻，按2.3.2.3項下方法處理后，按2.3.2.1項色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果白熱斯丸中胡椒堿平均加樣回收率為104.8%，RSD=4.05%，符合要求。

2.3.2.11樣品含量測定 精密稱取10批白熱斯藥丸，照2.3.2.3項下方法制備，并照2.3.2.1項色譜條件進(jìn)行測定，同時計算胡椒堿含量，結(jié)果見表2。

表2 白熱斯丸中胡椒堿含量測定結(jié)果 mg g-1

2.4 溶散時限

參照《中華人民共和國藥典》四部[12]丸劑項下，取白熱斯丸供試品6丸，選擇適當(dāng)孔徑篩網(wǎng)的吊籃(丸劑直徑在3.5 mm以上的用孔徑約2.0 mm的篩網(wǎng))，照崩解時限檢查法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則092)片劑項下的方法，加擋板進(jìn)行檢查，要求濃縮丸應(yīng)在2 h內(nèi)全部溶散。結(jié)果10批白熱斯丸的溶散時限均符合規(guī)定。

3 討論

為了有效控制白熱斯丸的質(zhì)量，對處方中的藥材進(jìn)行薄層鑒別，并采用高效液相色譜法對其中的有效成分進(jìn)行定量測定。同時參照《中華人民共和國藥典》四部通則項下丸劑標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了水分及溶散時限考察，結(jié)果表示，白熱斯丸符合《中華人民共和國藥典》項下規(guī)定，所建立的質(zhì)量控制方法適用于白熱斯丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

薄層色譜鑒別方法研究中，課題組前期從樣品制備、展開劑組成及比例的選擇、點樣量、不同品牌薄層板、展開環(huán)境(如溫度和濕度)等方面，對處方中的六味藥材的薄層色譜條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化。結(jié)果玫瑰花瓣和蓽茇薄層結(jié)果顯示，藥材、對照藥材及白熱斯丸在相同位置顯示相同斑點，且陰性無干擾，可作為薄層鑒別項，列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而處方中的其他藥材因無對照藥材或陰性有干擾，不列入。

含量測定中，本研究前期對白熱斯丸中槲皮素含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察，分別考察了提取方式、提取溶劑、水解時間、水解溫度、加鹽酸體積和鹽酸濃度，結(jié)果以加入甲醇后直接加入5 mL 50%鹽酸，80 ℃水浴水解50 min為最佳，并最終建立高效液相色譜法測定白熱斯丸中槲皮素的含量。白熱斯丸中胡椒堿含量測定分別考察了提取溶劑、超聲提取時間和超聲功率，結(jié)果以加入甲醇、50%超聲功率下超聲30 min為佳，最后進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察，建立了高效液相色譜法測定白熱斯丸中胡椒堿的含量。

白熱斯丸為傳統(tǒng)的民族藥復(fù)方制劑，主要用于治療白癜風(fēng)，在新疆的各大中醫(yī)醫(yī)院使用廣泛，臨床效果確切，但尚未有系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制影響較大，本研究按照丸劑要求，對白熱斯丸質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)研究，從薄層鑒別、含量測定、水分、溶散時限對自制的10批白熱斯丸進(jìn)行質(zhì)量控制研究，最終建立的方法適用性較強(qiáng)，可作為白熱斯丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了參考。