江枳殼HPLC指紋圖譜及標(biāo)志性成分含量測定研究△

孔慶國，張凱月，張曄，呂金朋，丁成健，李志成，張輝*

1.吉林省醫(yī)療器械檢驗所，吉林 長春 130062；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

枳殼是蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼性苦、辛、酸，溫，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等病癥。目前枳殼在我國長江流域及其以南各省區(qū)均有栽培[2]，主要產(chǎn)地有江蘇、浙江、江西、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、云南等省份，形成了多種來源的中藥枳殼商品藥材[3]，但同時也造成了臨床用藥混亂的局面。枳殼以湖南和江西的產(chǎn)品為佳。其中江西省新干的枳殼又名商州枳殼、三湖枳殼，具有“果肉厚，外翻如覆盆，瓤瓣數(shù)較多”的特點，其藥用的有效成分優(yōu)于其他品種[4]，簡稱江枳殼。江枳殼中有大量的揮發(fā)油，目前已能進(jìn)行含量測定的揮發(fā)油有50多種，主要有效成分為檸檬烯、蒎烯、蒎烯芳樟醇等，另外，還含有黃酮及生物堿類成分，主要的黃酮類成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、紅橘素等。主要的生物堿成分有辛弗林(synephrine)、酪胺(tyramine)、N-甲基酪胺(N-methytyramine)、喹諾林(qinoline)等[5]。本研究對不同批次江枳殼的指紋圖譜進(jìn)行比較并結(jié)合測定有效成分含量為江枳殼的質(zhì)量控制提供了量化數(shù)據(jù)，同時為江枳殼的規(guī)范化種植提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

800A型多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽機(jī)電有限公司)；BS110S型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)；1100型Agilent高效液相色譜儀(美國Aglient儀器公司)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WP-UP-10型精密型實驗室專用超純水機(jī)(上海捷惠科學(xué)儀器有限公司)；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

枳殼標(biāo)準(zhǔn)藥材(批號：120981-201104)、蕓香柚皮苷(批號：110721-201316)、柚皮苷(批號：111857-201102)、橙皮苷(批號：110722-201312)、新橙皮苷對照品(批號：10736-200628)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純，北京化工廠)；甲酸(色譜純，ANAQUA Chemicals)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Chemicals)；水為娃哈哈純凈水。枳殼采自江西九江，共10批次，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果實。

1.3 結(jié)果分析軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版功能：通過導(dǎo)入相關(guān)液相色譜圖，使用設(shè)參照譜、多點校正、自動匹配[8]、生成對照等功能對需要的色譜圖進(jìn)行比對分析，可以得到這一批色譜圖的相似度等信息。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取枳殼藥材，粉碎，精密稱取1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，選擇加甲醇30 mL，密塞，超聲處理30 min，取出放冷，用濾紙濾過，藥渣連同濾紙放回錐形瓶中再加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，用濾紙濾過[9]，合并兩次濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，既得。

2.2 對照品溶液的制備

取蕓香柚皮苷、柚皮苷，橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL各含80 μg的溶液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃；檢測波長為254 nm；流速為0.8 mL min-1。以乙腈為流動相A，以0.1%的甲酸溶液為流動相B按程序梯度洗脫(0～10 min，0%～5%A；10～15 min，5%～15%A；15～40 min，15%～35%A；40～70 min，35%～55%)；進(jìn)樣10 μL。色譜圖見圖1～3。

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。圖1 江枳殼HPLC圖

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。圖2 枳殼對照藥材HPLC圖

注：1.蕓香柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.柚皮苷。圖3 對照品HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 任意選取一個按照2.2下方法制備的對照品溶液，按2.3項下方法連續(xù)進(jìn)樣5次。相對保留時間的RSD為0.086%～0.808%，相對峰面積的RSD為1.901%～2.741%，表明方法的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 按照2.1下方法制備同一供試品溶液5份，按2.3下的液相條件進(jìn)樣，相對保留時間的RSD值為0.097%～1.991%，相對峰面積的RSD值為0.777%～2.866%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 按照2.1下方法制備供試品溶液，按2.3下色譜條件分別于第0、4、12、24、48 h進(jìn)樣，相對保留時間的RSD值為0.001%～0.011%，相對峰面積的RSD值為2.558%～2.928%，說明樣品至少在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A)對11批枳殼藥材(S1～S10為江枳殼藥材，S11為枳殼對照藥材)共計11批樣品的高效液相色譜圖進(jìn)行分析比較[10]，以探究其呈現(xiàn)的具有“指紋”意義的共有峰的相對保留時間、相對保留峰面積、相似度等數(shù)據(jù)。指紋圖譜的建立是為江枳殼的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。在11批枳殼樣品的高效液相色譜圖的基礎(chǔ)上[11]，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版的軟件，可建立該樣品的高效液相色譜指紋圖譜。

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷；S1～S10.江枳殼；S11.枳殼對照藥材；R.對照譜圖。圖4 11批枳殼的高效液相色譜指紋圖譜(λ=254 nm)

2.6 枳殼的高效液相色譜圖分析

枳殼的高效液相色譜可分離出10余個成分。經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件的對比，從中選取8個具有“指紋”意義和穩(wěn)定的共有峰。見表1。

2.7 共有峰的相對保留時間及相對峰面積

通過與對照品保留時間進(jìn)行比較，峰3為蕓香柚皮，峰4為橙皮苷，峰5為新橙皮苷，峰6為柚皮苷。橙皮苷在本實驗條件下實現(xiàn)了最佳的吸收度和較好的分離度，峰位居中，相對面積穩(wěn)定，故將橙皮苷色譜峰定為參照峰。計算各共有峰的相對保留時間及相對保留峰面積，見表2～3。

表1 11批枳殼8個共有峰峰面積

表2 11批枳殼的8個共有峰的相對峰面積

表3 11批枳殼的8個共有峰的相對保留時間

2.8 指紋圖譜相似度計算

參照“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”軟件計算得到11批枳殼樣品的高效液相色譜指紋圖譜的相似度[12-16]，見表4。

表4 11批枳殼的相似度

從表4可以看出，本實驗中11批枳殼樣品的高效液相指紋圖譜的相似度均在0.900以上，可初步判定這11批枳殼樣品的高效液相指紋圖譜相似。

2.9 枳殼中橙皮苷及柚皮苷的含量測定

2.9.1 線性關(guān)系考察 以2.2項下方法制成對照品溶液，分別吸取2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣，按2.3色譜條件測定。以峰面積為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，得到橙皮苷回歸方程：Y=776.13X+119.27(r=0.999 7)，橙皮苷線性范圍0.479～2.395 μg，柚皮苷回歸方程Y=840.91X+98.98(r=0.999 2)，柚皮苷線性范圍0.500 4～2.394 μg。

2.9.2 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液10 μL，在2.3項色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，計算橙皮苷、柚皮苷的峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.9.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一個按照2.1方法制備供試品溶液，分別于0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣。結(jié)果顯示，各色譜峰面積的RSD均小于2.0%。

2.9.4 重復(fù)性試驗 精密吸取同一個按照2.1方法制備供試品溶液，在2.3項色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，各色譜峰的峰面積RSD均小于2.0%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.9.5 加樣回收試驗 取已知含量的枳殼樣品約1 g，平行6份，精密稱定分別加入對照品適量，按2.1方法制備供試品溶液，按2.3項色譜條件下進(jìn)行分析，計算橙皮苷、柚皮苷的平均加樣回收率分別為98.95%、99.67%。

2.9.6 樣品含量測定 按照2.1方法制備11批供試品溶液，按2.3項色譜條件下分別測定橙皮苷、柚皮苷的的含量，含量測定結(jié)果見表5。

表5 江枳殼樣品中橙皮苷與柚皮苷含量測定 %

3 結(jié)論

枳殼的有效成分因其產(chǎn)地、氣候、采收時間、加工方法及品種不同有很大的差異[17-20]。本實驗利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”對11批枳殼藥材建立HPLC指紋圖譜，結(jié)果表明11批枳殼樣品具有比較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，相似度均在90%以上，符合《中華人民共和國藥典》要求。同時測定了11批枳殼樣品中橙皮苷和柚皮苷的含量，結(jié)果顯示不同樣品中兩種成分的含量差異不大。實驗結(jié)果表明，江西九江的10批江枳殼藥材無明顯差異。通過對指紋圖譜的相似度分析，結(jié)合主要成分的含量測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合的方法特征性及專屬性強(qiáng)，是枳殼質(zhì)量控制的一種有效、合理的方法，也可為其他傳統(tǒng)中藥的質(zhì)量評價提供參考。