黃芪薄層鑒別方法的改進△

歐陽羅丹，肖蘇萍*，尚興樸，王海蝶，王繼永，高永堅

1.中國中藥有限公司，北京 100195；2.江西中醫(yī)藥大學 藥學院，江西 南昌 330004；3.中國中藥控股有限公司，廣東 佛山 528303

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。該藥材于春、秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干。黃芪具有健脾補中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌之效[1]，可用于治療氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛等。黃芪在我國分布較為廣泛，中國大部分地區(qū)均有種植，主要產(chǎn)區(qū)有內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等[2]。黃芪中富含皂苷類、黃酮類等化合物，對免疫性疾病[3]、內(nèi)分泌性疾病[4]、血液病及心血管疾病[5]等有治療作用。為了全面地評價黃芪藥材的質(zhì)量，2015年版《中華人民共和國藥典》黃芪項下薄層色譜鑒別方法包括兩部分，一是以黃芪甲苷作為對照，鑒別黃芪中的皂苷類成分，二是以黃芪對照藥材為對照，鑒別黃芪中的黃酮類成分，兩種成分分別鑒別使黃芪鑒別操作復(fù)雜。其他文獻報道方法多僅鑒別皂苷或黃酮其中一種成分，客觀性和專屬性差，難以準確地反映和控制黃芪藥材的質(zhì)量。另外，2015年版《中華人民共和國藥典》黃芪項下薄層樣品的前處理包括加熱回流、柱層析、萃取等步驟，供試液的制備方法較為繁瑣。本實驗參考有關(guān)文獻，經(jīng)過反復(fù)試驗，摸索出了黃芪薄層鑒別的新提取方法，比《中華人民共和國藥典》方法操作簡便。通過研究，建立了一種較為理想的薄層鑒別展開系統(tǒng)。同時，經(jīng)本方法改良減少了氨蒸氣等有害試劑的使用。供試品色譜中所鑒別的成分斑點清晰，分離度好，耐用性佳。該方法可以替代原標準用于黃芪的鑒別。

1 材料

1.1 儀器

XB620M電子天平、XS205DU電子天平(瑞士Precisa)；DHG-9053A型鼓風干燥箱(上海飛越實驗儀器有限公司)；SD2800LHC數(shù)控超聲波清洗器(北京中晟銘科技有限公司)；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)visualizer、TCL半自動點樣儀Linomat(瑞士卡瑪)。

1.2 試劑

黃芪甲苷對照品、芒柄花素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110781-201717、111703-201504)；芒柄花苷對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：B20214)；正丁醇、甲醇、氨水、三氯甲烷、乙酸乙酯等試劑均為分析純；硅膠G板(200 mm×100 mm、100 mm×100 mm，青島海洋化工廠)。

黃芪藥材、飲片經(jīng)中國中藥有限公司肖蘇萍副研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，粉碎，過4號篩備用。黃芪藥材、飲片樣品信息見表1。

續(xù)表1

2 方法和結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》方法 取黃芪粉末3 g，加甲醇20 mL回流1 h濾過，濾液加于中性氧化鋁柱(100～120目，5 g，內(nèi)徑為10～15 mm)，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每l mL含l mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述2種溶液各2 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色點；紫外光燈(365 nm)下顯相同的橙黃色光點。

取黃芪粉末2 g，加乙醇30 mL回流20 min濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3%氫氧化鈉溶液15 rnL使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)pH值至5～6，用乙酸乙酯15 mL振搖提取，取乙酸乙酯液，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干。殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品液。另取黃芪對照藥材2 g同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取述2種溶液各10 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干置氨蒸氣中熏后，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點[6]。

2.1.2 改進方法

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取黃芪藥材粉末2 g，置50 mL離心管中，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，離心5 min(約3000×g)。取上清液備用，殘渣用甲醇洗滌2次，每次15 mL，超聲5 min，離心5 min，合并3次上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干。殘渣溶解于10 mL 10%(V/V)氨水溶液中，放置10 min，時時振搖。將溶液移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次(15、10、10 mL)。合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2.2 對照品溶液的制備 稱取黃芪甲苷對照品1 mg、芒柄花素對照品1 mg、芒柄花苷對照品1 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇適量使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.1.2.3 對照藥材溶液的制備 按供試品溶液的制備方法，取黃芪對照藥材2 g制成對照藥材溶液。

2.1.2.4 薄層鑒別 照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各6 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)的下層溶液作為展開劑，展開約8 cm，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇，105 ℃下烘烤約3 min至顯色，置紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。

2.1.3 方法驗證 取不同來源、不同批次或不同等級的11批黃芪藥材和33批黃芪飲片粉末，按照2.1.2項下方法進行試驗，黃芪藥材、飲片信息見表1。

2.2 結(jié)果

2.2.1 原方法結(jié)果 按2015年版《中華人民共和國藥典》黃芪項下薄層色譜鑒別方法進行試驗，在日光下檢視時，黃芪供試品中的黃芪甲苷斑點顯色較淺；在365 nm紫外光下檢視時黃芪供試品薄層色譜與黃芪甲苷對照品、對照藥材薄層色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，可有效鑒別黃芪，結(jié)果見圖1。

注：A.日光下檢視；B.365 nm紫外光燈下檢視；C.365 nm紫外光燈下檢視；D.改進方法254 nm紫外光燈下檢視；1.黃芪甲苷對照品；2.樣品S33；3.黃芪對照藥材；4.對照品混標，從上至下依次為芒柄花素、芒柄花苷、黃芪甲苷，下同；5.樣品S1。圖1 黃芪薄層色譜鑒別

2.2.2 改進方法結(jié)果 按照改進方法鑒別不同來源、不同批次或不同等級的11批黃芪藥材和33批黃芪飲片粉末，結(jié)果見圖2～5，44批黃芪供試品薄層色譜與黃芪甲苷、芒柄花素及芒柄花苷對照品、對照藥材薄層色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，斑點清晰，分離度好。

注：1.對照品混標；2.對照藥材；3～17.樣品S1～S15。圖2 不同產(chǎn)地黃芪飲片薄層色譜鑒別

注：1.對照品混標；2.對照藥材；3～14.樣品S16～S27。圖3 不同市場黃芪飲片薄層色譜鑒別

注：1.對照品混標；2.對照藥材；3～8.樣品S28～S33；9.樣品S1；10.樣品S10；11.樣品S16；12.樣品S23；13.樣品S34；14.樣品S35；15.樣品S36。圖4 不同來源黃芪飲片及藥材薄層色譜鑒別

注：1.對照品混標；2.對照藥材；3～10.樣品S8-S15；11～18.樣品S37～S44。圖5 不同來源黃芪飲片及藥材薄層色譜鑒別

注：1.蒙古黃芪對照藥材；2.膜莢黃芪對照藥材；3.對照品混標；4～6.樣品S1；7～9.樣品S45。圖6 蒙古黃芪與膜莢黃芪薄層色譜鑒別

3 分析與討論

3.1 各國藥典方法考察

2015版《中華人民共和國藥典》黃芪薄層鑒別方法包含兩部分，一是以黃芪甲苷為對照，以甲醇為溶劑，經(jīng)加熱回流、柱層析、萃取等步驟制備供試品溶液，采用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃顯色，并分別在日光及紫外光燈(365 nm)下觀察，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；二是以黃芪對照藥材為對照，以乙醇為溶劑，加熱回流、堿處理、萃取等步驟制備供試品溶液，采用三氯甲烷-甲醇(10∶1)為展開劑，置氨蒸氣中熏后，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點。該方法操作復(fù)雜，增加了黃芪鑒別的難度，且用到氨蒸氣等具有較大刺激性的試劑，對人體健康及環(huán)境具有一定危害。

“香港中藥材標準”黃芪薄層鑒別方法為以黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷為對照，以甲醇為溶劑，經(jīng)加熱回流、柱層析、萃取等步驟制備供試品溶液，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)的下層溶液為展開劑，以1 mL 50%稀硫酸和10 mL 2%(W/V)對-羥基苯甲醛甲醇溶液的混合溶液為顯色劑顯色，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點[7]。該方法僅能鑒定黃芪中的皂苷類成分，信息不夠全面，且前處理過程繁瑣，不易操作。

《日本藥局方》黃芪薄層鑒別方法為以黃芪甲苷為對照，以氫氧化鉀試液和乙腈的混合溶液為溶劑振搖提取制備供試品溶液，以乙酸乙酯-甲醇-水(20∶5∶4)為展開劑，以稀硫酸為顯色劑，105 ℃顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的黃棕色熒光斑點[8]。該方法僅能鑒定黃芪中的皂苷類成分。

《韓國藥典》黃芪薄層鑒別方法為以芒柄花素為對照，以甲醇為溶劑，經(jīng)加熱回流提取制備供試品溶液，以甲苯-甲醇(9∶1)為展開劑，置紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點[9]。該方法僅能鑒定黃芪中的黃酮類成分。

經(jīng)綜合分析，以上方法有的操作復(fù)雜，制備繁瑣；有的需用有害試劑，危害人體健康，污染環(huán)境；有的僅能鑒定黃芪中的一類成分，不能全面地反映黃芪的質(zhì)量。本實驗針對這些問題進行了改良，效果良好。通過《中華人民共和國藥典》方法和改進方法直觀比較(圖1)，分析認為，《中華人民共和國藥典》方法分別以黃芪甲苷和黃芪對照藥材為對照做2次實驗，操作較為繁瑣，改進方法只需要進行1次實驗，操作簡單。改進方法較《中華人民共和國藥典》方法增加了芒柄花素、芒柄花苷2個對照，可全面覆蓋黃芪的成分，且各對照的分離度良好，斑點清晰、Rf值適當?！吨腥A人民共和國藥典》方法需要分別獲取日光及紫外條件下的3張圖譜，改進方法只需要獲取紫外條件下的1張圖譜，便于結(jié)果的分析和不同樣品間圖譜的比對。相較《中華人民共和國藥典》方法，改進方法簡化了操作，而豐富了可鑒別的成分，且便于結(jié)果的分析。

3.2 對照物質(zhì)的選擇

2015版《中華人民共和國藥典》中黃芪的薄層色譜鑒別采用黃芪甲苷和黃芪對照藥材為對照，目的是全面反映黃芪中的皂苷和黃酮類成分，但分次檢驗增加了黃芪鑒別的難度。黃芪甲苷為黃芪皂苷類化合物的代表性成分，其具有強心、抗炎[10]、抑制膠原合成[11]等作用。芒柄花素和芒柄花苷為黃芪黃酮類化合物的代表性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗高血壓、清除自由基、抗氧化[12]等藥理作用。本實驗采用黃芪甲苷、芒柄花素、芒柄花苷和對照藥材同時作為黃芪薄層鑒別的對照，使方法具有科學性和完整性。

3.3 供試液制備方法的改進

原標準中供試品溶液的前處理采用加熱回流、柱層析等提取、分離方法，繁瑣費時，為簡化供試品的前處理方法，本實驗反復(fù)探索，考察了甲醇和乙腈作提取溶媒；回流和超聲2種提取方法，在此基礎(chǔ)上考察了萃取和大孔樹脂兩種純化方法及不同的堿處理方法。確定供試液的制備方法為：以甲醇作為溶劑，超聲提取，離心取上清液蒸干后以10%(V/V)氨水處理并用水飽和正丁醇萃取，再次蒸干，殘渣用甲醇溶解。相比《中華人民共和國藥典》原方法，本方法省去了加熱回流、柱層析的步驟，通過堿處理和萃取除去供試液中的雜質(zhì)，實驗結(jié)果斑點清晰，操作較為簡單。

3.4 薄層色譜條件的選擇

展開劑是薄層色譜鑒別的關(guān)鍵影響因素，為了獲得較好的分離度，本實驗考察了多個展開劑體系，包括三氯甲烷-甲醇(10∶1)；乙酸乙酯-甲醇-水(20∶5∶4)；甲苯-甲醇(9∶1)；三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)的下層溶液；三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液；水-甲醇-乙酸乙酯(10∶13.5∶100)。實驗結(jié)果顯示以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(20∶40∶22∶10)的下層溶液為展開劑時，展開斑點清晰、分離度好、對照品Rf值適當。

溫度和濕度是薄層色譜鑒別的影響因素。本實驗對展開環(huán)境的溫度和濕度進行考察，結(jié)果表明，在4～35 ℃，相對濕度30%～65%條件下，供試品色譜中主要斑點的分離度均較好，說明溫度和濕度對本方法的影響不大，方法耐用性佳。

3.5 黃芪藥材及飲片的鑒別

改進方法適用于蒙古黃芪和膜莢黃芪，可用于黃芪藥材及飲片的鑒別，效果良好，但對于黃芪不同來源、不同批次、不同等級間的差異比較，仍需要更精確的分析方法。

本實驗通過查找相關(guān)文獻，依據(jù)黃芪的化學成分，選用黃芪中皂苷類代表性成分黃芪甲苷及黃酮類代表性成分芒柄花素和芒柄花苷及對照藥材為對照，并經(jīng)過反復(fù)實驗，簡化了供試品的前處理，優(yōu)化了展開條件。相較《中華人民共和國藥典》方法，簡便易行，對照品有理想的分離效果，具有較好的科學性、完整性和耐用性，可獲得可靠的檢測結(jié)果，同時降低了試劑對環(huán)境的污染及人體的傷害，可替代原標準用于黃芪的鑒別。