LC-MS/MS測定大鼠血漿中煙花苷濃度及其藥代動力學(xué)和生物利用度△

賈田芊，田曼，翟思成，任麗，孫靜*

1.陜西科技大學(xué) 鎬京學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

黃花油點(diǎn)草來源于百合科Liliaceae植物黃花油點(diǎn)草Tricyrtismaculate的干燥全草，具有安神除煩、活血消腫之功效，用藥歷史悠久，療效突出，是跌打損傷重要品種之一。該藥材蘊(yùn)藏量較大，主要分布在陜西、四川、貴州等地海拔2300～2800米的山坡上。該植物是陜西重要的道地藥材，廣泛分布在秦嶺地區(qū)。近年來，黃花油點(diǎn)草引起了研究者廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，黃花油點(diǎn)草中黃酮類[1-4]成分在小鼠微循環(huán)、鼠血栓、急性腦梗阻具有很強(qiáng)的藥效。煙花苷[5-7](結(jié)構(gòu)如圖1，nicotiflorin)是黃花油點(diǎn)草主要成分之一，是一種連接有蕓香糖的黃酮醇苷類水溶性化合物，存在于多種植物當(dāng)中，現(xiàn)代藥理研究表明[8-10]其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛及神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性，并有較強(qiáng)的活血作用。

由于藥用植物屬于當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)品種，基礎(chǔ)研究較少，目前未有關(guān)于煙花苷體內(nèi)過程的報道。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11-14]并不斷探索，以柚皮苷為內(nèi)標(biāo)，建立了煙花苷的血漿藥物濃度LC-MS/MS測定方法并測定了煙花苷在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)和生物利用度，為進(jìn)一步提高煙花苷生物利用度及其臨床聯(lián)合治療提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 煙花苷結(jié)構(gòu)圖

1 材料

1.1 儀器

島津Nexera XR LC-20AD高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)，AB SCIEX QTRAP4500型質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)，KH-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司)，MS205DU十萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，EYELA MG-2200氮吹儀(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)，Allegra64R冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特有限公司)，SK-2渦旋振蕩器(上海奧然科貿(mào)有限公司)。

1.2 試劑與動物

煙花苷(批號：100080-201610，純度：91.9%)、柚皮苷(批號：K21F3C1，純度：98%)均來自上海源葉生物有限公司。甲醇、乙腈為色譜純(天津醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司)，磷酸為分析純(南通天昊化工有限公司)，水為娃哈哈純凈水。

雄性SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(200±20) g，[成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2015-030]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，5 μL)；流動相為乙腈(B)-0.1%磷酸(A)；梯度為0～10 min，15%～25%B，10～12 min，25%～15%B；柱溫 40 ℃；體積流量0.3 mL min-1；進(jìn)樣量 5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧電離(ESI)源，檢測方式：正離子檢測。采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式進(jìn)行掃描；離子化電壓(IonSpray Voltage)：-4500 V，氣簾氣(CUR)：241.325 kPa，離子源溫度(TEM)：550 ℃，噴撞氣(CAD)：Medium，噴霧器(Ion Source Gas 1)：344.75 kPa，輔助加熱(Ion Source Gas 2)：344.75 kPa。煙花苷和內(nèi)標(biāo)的離子對及質(zhì)譜見表1。

表1 煙花苷及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件

2.3 對照品溶液的制備

精密稱定煙花苷、柚皮苷適量，用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為1 mg mL-1煙花苷和1 mg mL-1柚皮苷儲備液，于4 ℃冰箱中保存待用，臨用時稀釋配制。

2.4 灌胃和尾靜脈方式給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)每組平行6只大鼠，一組先將煙花苷溶于1%的吐溫80中，后用0.5%羧甲基纖維素鈉進(jìn)行稀釋灌胃(50 mg kg-1)，給藥后5、10、20、40、50、60、70、90、120、180、240、480、720、1440 min進(jìn)行眼眶采血0.5 mL，置肝素抗凝離心管中，搖勻后離心，取上清液-20 ℃保存，采血過程中灌胃補(bǔ)充0.9%氯化鈉溶液；另一組將煙花苷溶于1%的吐溫80中，后用0.5%羧甲基纖維素鈉進(jìn)行稀釋尾靜脈注射(5 mg kg-1)，給藥后5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180、240、300、360、720、1440 min進(jìn)行眼眶采血0.5 mL，置肝素抗凝離心管中，搖勻后離心，取上清液-20 ℃保存，采血過程中灌胃補(bǔ)充0.9%氯化鈉溶液。

2.5 血漿樣品處理

吸取上清液200 μL，加入20 μL內(nèi)標(biāo)柚皮苷溶液(0.203 μg mL-1)，加500 μL甲醇，渦旋振蕩1 min，12 000 r min-1離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?50 μL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。

2.6 專屬性考察

取空白血漿、煙花苷對照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液以及大鼠給藥后血漿樣品適量，按2.5項(xiàng)方法處理后，在2.1項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果表明動物體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)不影響煙花苷的測定，見圖2。

注：A.空白血漿；B.含對照品的空白血漿；C.灌胃給藥后2 h血漿。圖2 煙花苷及內(nèi)標(biāo)MRM離子色譜圖

2.7 線性關(guān)系

取煙花苷儲備液適量，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。取0.5、1、5、10、50、100、200、500、1000、2000、5000、8000 ng mL-1煙花苷溶液各200 μL，氮?dú)獯蹈?，?00 μL血漿渦旋2 min，按2.3項(xiàng)方法處理后，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定相應(yīng)峰面積。以樣品血藥濃度平方分之一(1/X2)為橫坐標(biāo)，樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得煙花苷回歸方程Y=0.003X+0.02，(r>0.99)，煙花苷在0.5～8000 ng mL-1線性關(guān)系良好，按《中華人民共和國藥典》相應(yīng)方法求出最低檢測限(LLOD)的S/N≥3，定量下限(LLOQ)的S/N≥10，并于一天內(nèi)檢測6次，3 d檢測3批，計算所得RSD均小于15%，煙花苷的LLOD為0.5 ng mL-1，LLOQ為4 ng mL-1。

2.8 精密度與準(zhǔn)確度

精密吸取煙花苷的對照品溶液，加入空白血漿制成質(zhì)量濃度為1、50、500、5000 ng mL-1的煙花苷質(zhì)控樣品，按2.5項(xiàng)方法處理。不同質(zhì)控樣品各5份，連續(xù)5 d測定血漿日內(nèi)、日間精密度，見表2。

表2 血漿中煙花苷的精密度與準(zhǔn)確度(n=5)

2.9 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

1)精密吸取煙花苷對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液制成1、50、500、5000 ng mL-1的質(zhì)控樣品，按2.1條件下測定并記錄煙花苷及內(nèi)標(biāo)的峰面積A、B，平行測定5次。2)分別取6只不同來源的大鼠空白血漿各200 μL，按照2.5方法處理，向獲得的大鼠血漿樣品中加入煙花苷和內(nèi)標(biāo)溶液，制備成濃度為 1、50、500、5000 ng mL-1的QC樣品，取5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，獲得色譜圖峰面積分別為A1、B1。3)分別取1、50、500、5000 ng mL-1的QC樣品各200 μL，氮?dú)獯蹈?，加含?nèi)標(biāo)的大鼠空白血漿各200 μL，渦旋混勻按照2.5方法處理，獲得色譜圖峰面積分別為A2、B2。按照2015版《中華人民共和國藥典》指導(dǎo)原則計算歸一化后的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。結(jié)果見表3。

表3 煙花苷的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=6)

2.10 穩(wěn)定性

精密吸取煙花苷的對照品溶液，加入空白血漿制成1、50、500、5000 ng mL-1的煙花苷質(zhì)控樣品，按2.5項(xiàng)方法處理，平行制樣5份，分別置于20 ℃ 12 h，-80 ℃ 30 d，-20 ℃下反復(fù)凍融3次(每次間隔24 h)，4 ℃ 24 h，見表4。

表4 血漿中煙花苷在不同儲存條件下的穩(wěn)定性(n=5)

2.11 煙花苷的血漿藥動學(xué)

煙花苷灌胃給藥和尾靜脈注射給藥后，所得數(shù)據(jù)經(jīng)DAS藥代動力學(xué)軟件處理，采用藥代動力學(xué)程序進(jìn)行非房室模型擬合。藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表5，血藥濃度-時間曲線見圖3，根據(jù)公式(1)，計算煙花苷的口服生物利用度為1.7%。

口服生物利用度F=[(AUC口服×靜注的給藥劑量)/(AUC靜注×口服的給藥劑量)]×100%

(1)

注：A.灌胃給藥；B.靜脈注射給藥。圖3 煙花苷在大鼠血漿中的血藥濃度-時間曲線(n=6)

表5 煙花苷的藥代動力學(xué)參數(shù)

注：—表示沒有tmax值。

3 討論

本研究建立了一種簡便、靈敏的LC-MS/MS方法，用于研究煙花苷的藥代動力學(xué)及生物利用度。結(jié)果表明，煙花苷的色譜總運(yùn)行時間為12 min，LLOQ為0.5 ng mL-1，該方法快速、靈敏，可滿足更廣泛的檢測要求。

血漿處理方法選擇時，依照簡單、方便的原則選擇甲醇、10%的三氯乙酸、乙腈對血漿進(jìn)行一步沉淀處理，10%的三氯乙酸處理所得色譜圖中煙花苷回收率較低，故不選；乙腈處理所得色譜圖中出現(xiàn)非檢測成分的較大吸收峰，影響所選成分的檢測，故不選；甲醇處理所得色譜圖中煙花苷回收率良好，故選擇甲醇對其進(jìn)行沉淀蛋白。