壁虎/蟬擬青霉發(fā)酵菌質(zhì)粗提物抗腫瘤研究△

楊芳，趙崇妍，屈青松，楊鵬碩，韓璐，史新元*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

壁虎Gekkoswinhonis又名守宮，《本草綱目》記載：“守宮祛風(fēng)，石龍利水”，具有祛風(fēng)，活絡(luò)，散結(jié)之功效。大量基礎(chǔ)實驗和臨床研究證實壁虎對肝臟腫瘤具有抑制作用[1-2]。壁虎有效成分包括蛋白質(zhì)、馬蜂毒類物質(zhì)、多糖以及組織胺類，可產(chǎn)生顯著的攻毒療瘡、活血化瘀及散結(jié)止痛效果，目前認(rèn)為其主要活性成分為蛋白多肽類物質(zhì)[3-4]。臨床上，壁虎多以原蟲、原粉或超細(xì)粉入藥，存在分子量大，機體無法吸收的問題，而微生物生長代謝產(chǎn)生的酶可分解大分子蛋白，有利于機體吸收。已有大量文獻(xiàn)報道采用真菌與植物藥進行發(fā)酵，達(dá)到了增強藥效、產(chǎn)生新的性味功能及減少原藥材毒性的效果[5-6]。

蟬擬青霉Paecilomycescicadae是麥角菌科擬青霉屬真菌，屬蟲生性藥用真菌，寄生于一些蟬若蟲后形成的菌蟲復(fù)合體即為我國傳統(tǒng)中藥蟬花，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤活性[6-7]。利用微生物和中藥進行共發(fā)酵，一方面中藥為微生物生長提供營養(yǎng)，另一方面微生物生長代謝產(chǎn)生的酶，可對中藥中的某些成分進行分解或轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)出包含多種活性成分的制劑或新藥材[8]。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)蟬擬青霉能與壁虎進行雙向固體發(fā)酵，但壁虎發(fā)酵后其中主要有效物質(zhì)及活性會發(fā)生何種變化尚不明確。因此，本研究用凍融、超聲、Tris-HCl提取壁虎和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)中活性成分，并進行蛋白含量測定、SDS-PAGE分析及抗HepG2細(xì)胞活性評價，以期初步闡明壁虎/蟬擬青霉發(fā)酵后主要活性物質(zhì)蛋白質(zhì)及其活性的變化，為動物藥與真菌的雙向固體發(fā)酵及其開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高速萬能粉碎機(FW-100天津市泰斯特儀器公司)、電子天平(TLE303E賽多利斯科學(xué)儀器公司)、高速冷凍離心機(賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司)、冷凍干燥機(FD-1A-50上海比朗儀器制造公司)、BioTek酶標(biāo)儀(北京九宇金泰生物技術(shù)公司)、電泳儀(北京百晶生物技術(shù)公司)；超聲波清洗機(BILON10-250B上海比郎儀器制造公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱MCO-18AIC(UV)(日本三洋電器公司)、微孔振蕩器(2W-A常州榮華制造有限公司)。

1.2 試劑

三羥基氨基甲烷(Tris)(sigma，批號：101857977)、結(jié)晶牛血清白蛋白(sigma，批號：A8020)、考馬斯亮蘭G-250(Aladdin，批號：4072)、4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液(北京蘭博利德有限公司，批號：S4680)、4×SDS-PAGE分離膠緩沖液(北京蘭博利德有限公司，批號：S4880)、30%Acr-Bis(北京蘭博利德有限公司，批號：A3291)、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)(sigma，批號：T22500)、預(yù)染蛋白marker 10-100 KDa(sigma，批號：P1027)、細(xì)胞消化胰酶(sigma，批號：04181023)、DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號：1717148)、胎牛血清(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，批號：9080763)；二甲基亞砜(Aladdin，批號：101343298)；MTT(sigma，批號：0793)。

1.3 藥材

干壁虎：購于安徽省亳州市永剛飲片有限公司，經(jīng)北京益創(chuàng)生物科技研究院連增林教授鑒定系壁虎科動物無蹼壁虎GekkoswinhonisGunther的干燥全體。

菌種：蟬擬青霉，中國林業(yè)微生物保藏中心提供，編號：cfcc81169。

2 方法與結(jié)果

2.1 壁虎/蟬擬青霉發(fā)酵菌質(zhì)的制備

2.1.1 蟬擬青霉的活化 蟬擬青霉通過活化培養(yǎng)基活化，在27 ℃、相對濕度80%～90%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)5 d，挑取活化后的菌于PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r min-1搖床培養(yǎng)7 d備用。

2.1.2壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)的制備 取干壁虎藥材，粉碎，稱取5 g，均勻地放置于培養(yǎng)皿中，滅菌后接入5 mL蟬擬青霉菌液，放入28 ℃、相對濕度80%恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，待長滿菌絲后停止發(fā)酵，取出壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)，冷凍干燥，粉碎，-20 ℃保存。

2.2 壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)有效成分的粗提

2.2.1 凍融法 分別取10 g干壁虎粉(B)、壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)粉(Z)，加2倍純水，搖勻，-80 ℃速凍30 min，37 ℃溶解，反復(fù)10次，12 000 r min-1、4 ℃離心20 min，取上清，沉淀加水反復(fù)凍融5次，合并上清，濾紙過濾，冷凍干燥，得到壁虎凍干粉(DB)和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)凍干粉(DZ)，-20 ℃保存。

2.2.2 超聲波法 分別取10 g B、Z于研缽中，液氮研磨破碎，加10倍純水，混勻，4 ℃超聲2 h，12 000 r min-1、4 ℃離心20 min，取上清，沉淀繼續(xù)超聲2 h，重復(fù)3次，合并上清液，濾紙過濾，冷凍干燥，得到壁虎凍干粉(CB)和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)凍干粉(CZ)，-20 ℃保存。

2.2.3 Tris-HCl緩沖液 配制pH 8.0、濃度60 mmol L-1的Tris-HCl緩沖液，研缽置于冰盒上預(yù)冷。分別取10 g B、Z 于研缽中，液氮研磨破碎，加20 mL Tris-HCl緩沖液研磨20 min，于12 000 r min-1、4 ℃離心20 min，取上清，沉淀加20 mL Tris-HCl緩沖液繼續(xù)研磨20 min后離心，重復(fù)3次，合并上清液，濾紙過濾，冷凍干燥，得到壁虎凍干粉(TB)和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)凍干粉(TZ)，-20 ℃保存。

2.3 蛋白質(zhì)含量的測定

本研究采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量[9]。分別取6個樣品粉末0.5 g純水配成質(zhì)量濃度為50 mg mL-1的樣品液，測其蛋白質(zhì)含量，每個質(zhì)量濃度3個平行。

2.4 蛋白分子量分析

本研究采用SDS-PAGE電泳法進行蛋白質(zhì)分子量分析[10]。本文SDS-PAGE采用5%濃縮膠和15%分離膠，上樣量15 μL，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，電泳結(jié)束后，用G-250考馬斯亮藍(lán)加熱染色1 min，脫色，用成像儀進行成像。

2.5 MTT檢測樣品對HepG2細(xì)胞的抑制率

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞5×104個/mL接種于 96 孔板，100 μL/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，吸去原培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為4、6、8、10、12、14 mg mL-16個樣品的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg mL-1MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，在490 nm波長處測其吸光度(A)，按公式計算各組細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率=[(1-A實驗組)/A對照組]×100%

(1)

半數(shù)抑制濃度(IC50)計算：繪制細(xì)胞增殖抑制量效關(guān)系曲線，利用SPSS 20.0軟件，根據(jù)抑制率(IR)的量效曲線計算藥物對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度。

2.6 數(shù)據(jù)處理

2.7 結(jié)果

2.7.1 蛋白含量測定結(jié)果 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.362 3X+0.253 8，r=0.993 2，標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在0.1～1.2 mg mL-1呈良好線性關(guān)系。表1為不同提取方式所得樣品量及蛋白質(zhì)含量，由表知，壁虎發(fā)酵前提取所得蛋白含量均高于發(fā)酵后，可見蟬擬青霉的生長代謝分解了壁虎中的部分蛋白。不同提取方式所得蛋白質(zhì)含量差異較大，超聲波提取方式蛋白質(zhì)含量最高。

2.7.2 壁虎和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)SDS-PAGE結(jié)果分析 如圖1所示，壁虎中的蛋白質(zhì)組成較多，10～15 kDa的蛋白最多，但菌質(zhì)中的蛋白條帶均消失，進一步說明蟬擬青霉的生長代謝分解了壁虎中的大分子蛋白。

表1 不同提取方式樣品中的蛋白質(zhì)含量

注：用t檢驗法進行分析。同一列中相同提取方式壁虎發(fā)酵后和發(fā)酵前相比，*P<0.05；同一列中不同提取方式壁虎發(fā)酵后與DZ相比，#P<0.05。

注：DB、DZ：凍融法提取壁虎、菌質(zhì)中的粗蛋白，CB、CZ：超聲波法提取壁虎、菌質(zhì)中的粗蛋白，TB、TZ：Tris-HCl法提取壁虎、菌質(zhì)中的粗蛋白。圖1 壁虎和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)不同提取方式蛋白組分電泳圖譜

2.7.3壁虎和壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)抗腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)果分析 根據(jù)MTT實驗結(jié)果，計算出壁虎和蟬擬青霉發(fā)酵前后不同提取方式的IC50值，由圖2知，不同提取方式粗提物對HepG2細(xì)胞增殖活性均有一定程度的抑制作用；壁虎/蟬擬青霉發(fā)酵菌質(zhì)粗提物的IC50值均比壁虎低，說明壁虎經(jīng)過蟬擬青霉發(fā)酵后，體外抗HepG2腫瘤細(xì)胞增殖活性增加。在超聲波提取方式中，壁虎IC50=27.825 mg mL-1，壁虎/蟬擬青霉發(fā)酵菌質(zhì)IC50=10.769 mg mL-1，降低了約50%，對比3種提取方式，超聲波提取所得粗提物活性最高。

注：*P<0.05；**P<0.01。圖2 壁虎發(fā)酵前后不同提取方式體外抗HepG2腫瘤細(xì)胞的IC50值

3 討論

雙向發(fā)酵技術(shù)是藥用真菌以中藥材作為基質(zhì)進行生長代謝，中藥材為真菌生長提供營養(yǎng)成分，而真菌生長代謝所產(chǎn)生的酶又能作用于藥材基質(zhì)，使其朝活性更高或毒性更低方向轉(zhuǎn)化[11-14]。近年來雙向發(fā)酵研究通常針對植物藥開展，鮮見動物藥相關(guān)報道。動物藥也是中藥的重要組成部分，其抗腫瘤活性物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)多肽類、甾類、脂肪族類和微量元素，其中蛋白質(zhì)多肽類為主要的活性物質(zhì)[15]，在中醫(yī)藥臨床應(yīng)用中，動物藥物多以原蟲、原粉或超細(xì)粉入藥，存在制劑量大，機體無法高效吸收的缺點[16-17]，將動物藥與真菌進行雙向發(fā)酵，不僅可以擴展動物藥的入藥方式，而且還可以利用真菌分解動物藥中的大分子物質(zhì)，使其更易被人體吸收。

大量的臨床報道證明，中藥壁虎對許多病癥療效確切，且毒性小，特別對瘰疬癌腫等方面有獨特的療效，是一味重要的抗癌動物藥[18-19]，目前雙向發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)運用到多種中藥材的增效減毒中，但利用壁虎進行生物發(fā)酵方面的研究還未見報道。本研究將壁虎和蟬擬青霉進行雙向固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)壁虎經(jīng)蟬擬青霉發(fā)酵后菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量降低，且大分子蛋白消失，說明蟬擬青霉的生長代謝分解了壁虎中部分大分子蛋白，MTT實驗表明壁虎發(fā)酵后誘導(dǎo)HepG2腫瘤細(xì)胞凋亡的IC50值降低，說明壁虎經(jīng)蟬擬青霉發(fā)酵后藥效增強。本研究為動物藥和真菌進行雙向固體發(fā)酵的可行性提供了理論依據(jù)，但壁虎/蟬擬青霉菌質(zhì)提取物中成分較復(fù)雜，到底是哪一種或哪幾種成分發(fā)揮藥效，需要進一步對其進行分離純化及活性驗證。