白藜蘆醇對(duì)卵巢癌增殖、遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制

李 可，康 玉，陳 行*

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011）

目前，卵巢癌的主要治療方式為手術(shù)聯(lián)合鉑類、紫杉醇等一線化療，雖然患者獲得比較滿意的近期療效，但5年生存率仍然徘徊在30%～40%[1]。白藜蘆醇是一類廣泛存在與植物中的多酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化甚至抗腫瘤的活性[2-3]。近年來，白藜蘆醇的抗腫瘤作用在多個(gè)癌種中被驗(yàn)證，但是白藜蘆醇對(duì)卵巢癌的抑制及其機(jī)制還不清楚。本研究擬采用多種人上皮性卵巢癌細(xì)胞系，研究白藜蘆醇對(duì)卵巢癌的抑制作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人上皮性卵巢癌:SKOV3,OVCAR3,OVCAR5,OVCA R8,CAOV3,ES2細(xì)胞由上海市腫瘤所惠贈(zèng)。白藜蘆醇購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(R5010純度≥98%)；CCK8（Cell Counting Kit-8）試劑購(gòu)自日本同仁公司（CK-04）。培養(yǎng)基RPMI-1640、DMSO、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白試劑定量盒(美國(guó)Pierce公司)；β-ACTIN和GAPDH多克隆抗體美國(guó)Cell signaling Technology公司；Nrf2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab137550）；CO2培養(yǎng)箱和多功能酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將購(gòu)買的人卵巢癌細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，制成細(xì)胞懸浮液，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基中(10%胎牛血清，100 U／ml青霉素，100 mg／ml鏈霉素)，常規(guī)培養(yǎng)于37℃，5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，予以換液1～2天/次，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后傳代。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。采用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用one-way ANOVA對(duì)多組間樣本均數(shù)進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖分析。計(jì)量資料記錄方式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖情況的影響

選擇四種卵巢癌細(xì)胞系，將對(duì)照組（僅培養(yǎng)液）的細(xì)胞活性設(shè)置為100%，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇（不同濃度梯度）處理后，卵巢癌細(xì)胞的活性逐漸降低，且呈藥物濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 白藜蘆醇處理不同卵巢癌細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡技術(shù)，與對(duì)照組（僅DMSO）相比，白藜蘆醇處理組凋亡顯著，且呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 白藜蘆醇處理卵巢癌細(xì)胞后Nrf2基因水平的表達(dá)

利用PCR檢測(cè)白藜蘆醇處理卵巢癌細(xì)胞系后Nrf2在mRNA水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（僅培養(yǎng)液），加入白藜蘆醇后Nrf2表達(dá)升高。

2.4 白藜蘆醇處理卵巢癌細(xì)胞后Nrf2蛋白水平的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，使用白藜蘆醇處理卵巢癌細(xì)胞系24和48小時(shí)后，Nrf2蛋白表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組Nrf2蛋白表達(dá)相比，白藜蘆醇處理卵巢癌細(xì)胞24和48小時(shí)后的Nrf2蛋白表達(dá)增強(qiáng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

卵巢癌因其發(fā)病隱匿、診斷多為晚期且較易耐藥復(fù)發(fā)，是死亡率位居首位的婦科惡性腫瘤。其不斷增殖和失巢凋亡的特性，其致死率居高不下，因此，探究抑制卵巢癌的增殖和失巢凋亡的藥物，是抑制卵巢癌進(jìn)展，提高生存率的關(guān)鍵。目前，大量研究表明白藜蘆醇可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

白藜蘆醇是1940年首次發(fā)現(xiàn)的植物提取化合物，因其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，近幾年引起眾多研究人員的重視。Jang等首次提出白藜蘆醇具有抗癌活性，其能夠通過多條途徑調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成，且具有極低的毒性及副作用。本研究表明，白藜蘆醇組多種卵巢癌細(xì)胞的增殖能力顯著低于對(duì)照組，且細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示白藜蘆醇能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，并能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探索白藜蘆醇抑制卵巢癌增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，我們通過檢索大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有激活核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nrf2)的作用，而Nrf2的激活障礙與癌癥進(jìn)展有著密切相關(guān)性。本研究表明，白藜蘆醇組Nrf2表達(dá)水平無論是在mRNA水平水平還是蛋白水平，均表達(dá)增加，提示白藜蘆醇能夠通過上調(diào)Nrf2表達(dá)水平抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，目前盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者在白藜蘆醇抗女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤方面的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但針對(duì)其具體作用機(jī)制的研究還不是十分深入。由于白藜蘆醇可以對(duì)多種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤起到抑制生長(zhǎng)促進(jìn)凋亡的作用，再加上其無毒副作用的優(yōu)勢(shì)，因此有望成為新一代的抗腫瘤藥物。