利用鑭系金屬探針的順磁及發(fā)光特性研究蛋白質(zhì)相互作用

吳 桐

（浙江外國語學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310023）

在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移、基因表達(dá)等多項生理活動中，都會發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用。所以在生命科學(xué)研究中，需要對蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行深入研究。但從實踐情況來看，采用傳統(tǒng)核磁共振、熒光檢測等技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用觀察，容易遭遇蛋白質(zhì)標(biāo)記問題，需要借助鑭系金屬探針特性加強蛋白質(zhì)標(biāo)記，從而得到科學(xué)的研究結(jié)果。

1 鑭系金屬探針的順磁及發(fā)光特性

作為稀土元素，鑭系金屬中的釓元素帶有顯著的順磁特性，鋱元素則具有較好發(fā)光特性。釓離子擁有半充滿f軌道和各向同性g張量，自旋量子數(shù)較大，同時擁有較長弛豫時間[1]。利用順磁探針提供的未配對電子與核間相互作用，可以加快弛豫速率，同時不會引起交叉相干弛豫，能夠提供簡單的數(shù)據(jù)分析過程。借助溶液核磁共振技術(shù)，能夠使釓的順磁弛豫得到增強，從而對蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行標(biāo)記。在核磁共振實驗中，順磁弛豫增強的大小與電子和核間距離成正比關(guān)系，電子擁有較大磁矩，能夠?qū)崿F(xiàn)長距離監(jiān)測，因此能夠用于研究蛋白質(zhì)相互作用。鋱的發(fā)射譜在可見光區(qū)域內(nèi)，熒光壽命達(dá)毫秒級。采用熒光波譜學(xué)技術(shù)，可以實現(xiàn)時間延遲檢測，將納秒量級背景熒光去除，從而使鋱成為發(fā)光探針對蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行標(biāo)記，使熒光技術(shù)在蛋白質(zhì)特異性檢測上的不足得到彌補[2]。針對分子量較大的蛋白質(zhì)，采用核磁共振等技術(shù)難以實現(xiàn)結(jié)構(gòu)解析。利用鋱?zhí)结樳M(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)、裝配和動態(tài)變化進(jìn)行分析，因此可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的研究。

2 利用鑭系金屬探針研究蛋白質(zhì)相互作用

（1）利用釓探針研究蛋白質(zhì)相互作用。在對蛋白質(zhì)相互作用展開研究時，利用釓探針順磁特性，通過增強順磁弛豫能夠提供距離信息約束，實現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)系綜優(yōu)化精修，對生物大分子復(fù)合體瞬時構(gòu)象進(jìn)行觀測，確定蛋白質(zhì)間發(fā)生的相互作用。采用該方法，能夠獲得較之電子質(zhì)子更短的基態(tài)結(jié)構(gòu)，得到低分布頻率構(gòu)象，因此能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)相互作用進(jìn)行動態(tài)研究。在研究大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)時，細(xì)胞信號傳導(dǎo)需要通過蛋白質(zhì)磷酸化作用實現(xiàn)。但是從生物信息學(xué)角度來看，在數(shù)以萬計蛋白質(zhì)間，僅幾千個蛋白質(zhì)復(fù)合體能夠獲得原子水平分辨率結(jié)構(gòu)信息，其中能夠?qū)崿F(xiàn)信號傳導(dǎo)的則更少。針對蛋白質(zhì)復(fù)合體擁有較高分辨率結(jié)構(gòu)信息的特征，需要采用釓探針實現(xiàn)核磁共振實驗中順磁弛豫增強，對弱相互作用遭遇的蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行檢測，從而得到相應(yīng)結(jié)構(gòu)信息。

實驗需要以大腸桿菌基因為模版實現(xiàn)定點突變，利用非同位素進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，然后實現(xiàn)核磁共振滴定。在整個過程中，酶I（EI）C末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)，需要對磷酸烯醇式丙酮酸的水解作用進(jìn)行催化，促使其N端結(jié)構(gòu)域（EIN）實現(xiàn)自動磷酸化，將基團(tuán)傳遞至組氨酸磷酸運載蛋白，最終傳遞至酶IIA（EIIA）。研究EI與EIIA間發(fā)生的相互作用，可以進(jìn)行二者間核磁共振滴定實驗，利用釓探針在EIIA突變體和D144C突變體中進(jìn)行釓離子的引入。通過研究發(fā)現(xiàn)，EI和EIIA間平衡解離常數(shù)約13mM，說明二者之間存在較弱相互作用，能夠證明EI和EIIA間并非直接相互作用。通過對磷酸化酶促反應(yīng)進(jìn)行測定可以發(fā)現(xiàn)，EIIA能夠被EI直接磷酸化，缺失突變體的酶則會對這一過程進(jìn)行抑制，因此可以說明Hpr酶未參與到磷酸化過程中。在實驗期間，能夠檢測發(fā)現(xiàn)EI-EIIA復(fù)合體的存在，但是存在時間和比例均較少。由此可見在蛋白質(zhì)間發(fā)生極弱相互作用時會對復(fù)合體進(jìn)行遭遇，但在各種因素調(diào)節(jié)下能夠達(dá)到結(jié)合與解離間的平衡，保證細(xì)胞信號順利傳播。

（2）利用鋱?zhí)结樠芯康鞍踪|(zhì)相互作用。實際上，細(xì)胞中各種生理活動需要利用不同信號通路實現(xiàn)，各通路之間會發(fā)生交叉對話。蛋白質(zhì)作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點，需要通過相互作用實現(xiàn)信號傳遞。采用熒光技術(shù)，可以利用熒光分子間能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用研究，即根據(jù)熒光分子發(fā)射光譜和受體間光譜重疊情況確定距離約束信息，對蛋白質(zhì)動態(tài)學(xué)信息進(jìn)行獲取。但是由于生物樣本自發(fā)熒光，采用有機(jī)小分子探針對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記會出現(xiàn)非特異性問題。采用鋱?zhí)结?，可以通過電子自旋禁阻軌道躍遷發(fā)光，只有較小的發(fā)光系數(shù)，能夠利用有機(jī)生色基團(tuán)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，在紫外激發(fā)下發(fā)出綠光，從而通過扣除納秒級熒光壽命實現(xiàn)蛋白質(zhì)特異性檢測。在活細(xì)胞中，利用有色氨酸的結(jié)合標(biāo)簽，能夠使鋱離子與目的蛋白質(zhì)融合。標(biāo)簽中的天冬氨酸等可以與鋱離子構(gòu)成穩(wěn)定配位化學(xué)鍵，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)記。

在研究半胱氨酰白三烯受體CysLTR時，可以在基因中不同位點進(jìn)行結(jié)合標(biāo)簽突變質(zhì)粒的插入，利用數(shù)據(jù)庫對氨基酸序列展開分析。由于其是細(xì)胞膜外N末端進(jìn)行的多次跨膜蛋白，通過插入結(jié)合標(biāo)簽，能夠使N末端和膜外loop環(huán)對鋱離子進(jìn)行結(jié)合，實現(xiàn)受體標(biāo)記。利用標(biāo)記的hCysLTR對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行刺激，可以借助標(biāo)記物中激動劑白三烯D4實現(xiàn)，然后對細(xì)胞內(nèi)鈣增高情況進(jìn)行測定。從研究結(jié)果來看，利用含結(jié)合標(biāo)簽的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，相較于野生型受體，得到的受體不會出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣增高的情況。在結(jié)合標(biāo)簽與hCysLTR之間進(jìn)行甘氨酸的插入，能夠?qū)崿F(xiàn)柔性鏈接。從細(xì)胞內(nèi)鈣的檢測結(jié)果來看，依然無反應(yīng)，可知增加柔性鏈接長度無法產(chǎn)生刺激作用。由于鋱的激發(fā)波段為紫外，不利于生物樣本觀察，因此可以引入喹諾酮，采用更長波長實現(xiàn)激發(fā)。

采用光學(xué)顯微鏡成像法進(jìn)行觀測，可以發(fā)現(xiàn)鋱離子對細(xì)胞形態(tài)和活性不會產(chǎn)生顯著影響。利用多光子顯微鏡進(jìn)行鋱標(biāo)記的蛋白觀察，可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的蛋白質(zhì)和未標(biāo)記的蛋白質(zhì)都發(fā)出了微弱熒光，與細(xì)胞自發(fā)背景熒光被激發(fā)有關(guān)。對微妙延遲檢測時間進(jìn)行設(shè)置可以發(fā)現(xiàn)，未插入結(jié)合標(biāo)簽的蛋白質(zhì)熒光完全消失，但是利用鋱標(biāo)記特異性蛋白質(zhì)依然發(fā)光。由此可見，在膜外loop區(qū)蛋白質(zhì)標(biāo)記檢測方面，可以采用鋱?zhí)结槍Φ鞍踪|(zhì)相互作用進(jìn)行研究。采用該方法，利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞觀察，可以發(fā)現(xiàn)鋱離子對蛋白質(zhì)做出的特異性標(biāo)記。

3 結(jié)論

通過研究可以發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域，采用傳統(tǒng)的熒光檢測技術(shù)和核磁共振技術(shù)容易遭遇蛋白質(zhì)標(biāo)記問題。而對鑭系金屬探針進(jìn)行運用，能夠借助釓探針順磁特性和鋱?zhí)结槹l(fā)光特性實現(xiàn)蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記，為研究蛋白質(zhì)相互作用提供支持。因此在實踐工作中，還應(yīng)加強鑭系金屬探針特性分析，以便實現(xiàn)探針合理利用，滿足蛋白質(zhì)相互作用研究需求。