甲連盆腔膠囊對慢性盆腔炎大鼠組織學(xué)及炎性因子的影響

楊 靜，葉 濤，易 剛，王 磊，李 娟，劉 婭，王永周*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，四川 瀘州 646000）

慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是女性內(nèi)生殖器官、周圍結(jié)締組織以及盆腔腹膜的慢性炎癥，以不孕、異位妊娠、慢性盆腔痛及盆腔炎性疾病反復(fù)發(fā)作為主要表現(xiàn)，在我國發(fā)病率較高，約40%，近年來盆腔手術(shù)的增加，有逐年上升趨勢。該病病程長、易反復(fù)，嚴重影響女性的生活質(zhì)量，以抗生素和手術(shù)治療為主的西醫(yī)療法副作用大，而中醫(yī)藥對此凸顯出明顯的優(yōu)勢。甲連盆腔膠囊是我院自主研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，已運用于臨床實踐多年，療效確切[1]，本實驗通過建立CPID大鼠模型，旨在從組織學(xué)及炎性因子方面探討甲連盆腔膠囊對CPID的療效和可能的作用機制，為其臨床運用提供理論支持和實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

雌性未孕清潔級SD大鼠80只，8周齡，體重（200±20）g，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-17，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥物與試劑

甲連盆腔膠囊（由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號：20181023）。婦科千金膠囊（生產(chǎn)公司：株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號：20181139）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-2（IL-2）ELISA試劑盒購自上海橋杜生物科技有限公司；戊巴比妥鈉、苯酚、甘油、黃耆樹膠粉等購自中國醫(yī)藥集團上海試劑公司。

1.1.3 實驗儀器

DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱；5424高速離心機；Model 680酶標(biāo)儀；Thermo 991超低溫冰箱；80i正置熒光顯微。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

數(shù)字牌固定于大鼠左側(cè)耳緣標(biāo)號，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組，每組15只，余50只為造模組。

1.2.2 模型建立及鑒定

50只造模組大鼠參照文獻采用苯酚膠漿法造模[2]。具體方法：大鼠禁食不禁飲12小時，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射，麻醉滿意后，備皮消毒，下腹正中作一長約2 cm切口，進入腹腔，暴露子宮，眼科鑷夾住左側(cè)子宮近輸卵管端，1mL注射器向左側(cè)宮腔緩慢推注25%的苯酚膠漿0.02 mL（由液化苯酚、甘油、黃耆樹膠粉制成），分層關(guān)腹，消毒術(shù)區(qū)，放入鼠籠保暖復(fù)蘇。假手術(shù)組按上述方法開腹，注射同等劑量生理鹽水后關(guān)腹。造模10天后，隨機取3只大鼠左側(cè)子宮組織，HE染色后，光鏡下觀察，確定造模成功后，再將造模組大鼠隨機分為模型組、婦科千金膠囊組和甲連盆腔膠囊組。

1.2.2 給藥干預(yù)

造模第11天開始灌胃，干預(yù)組大鼠灌胃量按照成人60 kg所用藥量換算，甲連盆腔膠囊組1.48 g/kg，婦科千金膠囊組0.5 g/kg，余組大鼠均用4 mL生理鹽水灌胃。灌胃7天重新稱重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量，每天灌胃1次，連續(xù)14天。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況觀察

觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、二便及活動情況，觀察皮膚手術(shù)切口有無感染、有無意外死亡等。

1.3.2 盆腔大體情況觀察

末次灌胃后禁食禁飲12小時，同前述麻醉開腹，肉眼觀察盆腔臟器形態(tài)大小、色澤，有無粘連、積液等情況。

1.3.3 子宮組織學(xué)觀察

肉眼觀察完畢后，取下左側(cè)子宮組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察并拍照。

1.3.4 血清TNF-α、IL-2水平檢測

腹主動脈采血離心（3000 r/min×20 min），取上清液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附測定法（ELISA），遵循試劑盒說明書操作，測定TNF-α、IL-2的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

整個實驗周期大鼠精神狀態(tài)好，活動、飲食、二便等無異常，手術(shù)切口未見感染。造模過程中麻醉過量死亡2只，用于模型鑒定取材3只，假手術(shù)組術(shù)后第二天縫線斷裂臟器脫出造成感染死亡1只，模型組采血失敗1只，最終納入分析的大鼠：空白組（n=15），假手術(shù)組（n=14），模型組（n=14），婦科千金膠囊組（n=15），甲連盆腔膠囊組（n=15）。

2.2 盆腔大體情況觀察

空白組和假手術(shù)組盆腔臟器形態(tài)規(guī)則對稱，顏色紅潤，無積液及粘連形成；模型組子宮左側(cè)與右側(cè)相比，明顯充血水腫，質(zhì)地較硬，管腔狹窄，與周圍組織粘連；治療組（甲連盆腔膠囊組和婦科千金膠囊組）左側(cè)子宮組織充血減輕，質(zhì)地柔軟，與周圍組織無明顯粘連。

2.3 子宮組織形態(tài)學(xué)觀察

空白組和假手術(shù)組表現(xiàn)相似，子宮壁結(jié)構(gòu)清晰，上皮組織及腺體完整，無炎性細胞浸潤，肌纖維排列整齊；模型組子宮壁結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細胞增生，明顯變性、壞死區(qū)，大量炎性細胞浸潤，周圍結(jié)締組織增生明顯；治療組子宮壁組織結(jié)構(gòu)基本清晰，少量炎性細胞浸潤，腺體完整，纖維組織輕度增生。見圖1。

圖1 大鼠子宮組織切片光鏡下圖像（HE，×200）

2.4 血清TNF-α、IL-2水平檢測

與空白組和假手術(shù)組比較，模型組血清TNF-α、IL-2水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，治療組TNF-α、IL-2水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較

表1 各組大鼠血清IL-2、TNF-α水平比較

注：與空白組和假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 例數(shù)（n）TNF-α（pg/mL） IL-2（pg/mL）空白組 15 209.5±31.7 877.3±141.6假手術(shù)組 14 217.1±20.9 900.46±126.7模型組 14 334.0±51.51） 1182.7±261.61）婦科千金膠囊組 15 255.7±37.32） 1029.0±161.72）甲連盆腔膠囊組 15 244.7±37.62） 1004.0±158.22）

3 討 論

慢性盆腔炎（CPID），又叫盆腔炎性疾病后遺癥（SPID），是育齡期婦女常見病，多發(fā)病，中醫(yī)治療方法靈活、干預(yù)靶點多重、給藥途徑多樣，且毒副作用較小，從古至今已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗。其具體發(fā)病機制尚未完全闡明，諸多研究表明該病的發(fā)生發(fā)展與機體內(nèi)炎性細胞因子的異常表達密切相關(guān)，持續(xù)的的炎性介質(zhì)活化和滲出會進一步引起組織病理性損傷，損傷修復(fù)過度，最終導(dǎo)致廣泛粘連，增生和瘢痕形成等自身免疫性病變，這些病變又反過來加重炎癥反應(yīng)[3]。血液中炎性因子的改變是機體炎癥的反應(yīng)，IL-2是趨化因子家族中的一員，具有多向性作用，能介導(dǎo)T、B細胞活化、增殖和分化，維持T細胞穩(wěn)定，并增強NK細胞的殺傷力[4]，在機體免疫應(yīng)答和抗感染中有著重要作用。TNF-α主要是由單核巨噬細胞分泌的促炎因子，誘導(dǎo)各種趨化因子和促炎因子的合成釋放，在炎癥初期，可增強機體的抗感染作用，但持續(xù)高表達會導(dǎo)致過度免疫反應(yīng)，出現(xiàn)細胞毒性作用，從而加重炎癥和組織損傷，是腹腔粘連形成的一個重要標(biāo)志物[5]。

祖國醫(yī)學(xué)認為CPID的病因歸結(jié)于“濕、熱、寒、瘀、虛”，現(xiàn)代研究表明，濕熱是致病的主要因素，瀘州地處川蜀，地域氣候和飲食習(xí)慣使當(dāng)?shù)厝烁资軆?nèi)外濕熱邪氣所侵[6]，因此，濕熱瘀結(jié)證歷來認為是川蜀地區(qū)最常見的證型。四川名中醫(yī)莊誠老教授，根據(jù)因地制宜原則，結(jié)合數(shù)十年臨床經(jīng)驗，創(chuàng)立了甲連盆腔湯，為方便患者服用，我院改良成膠囊制劑，臨床療效滿意。方中銀花、連翹、紫花地丁、蒲公英主以清熱解毒，輔以椿皮除濕止帶，桔梗辛散排膿，鱉甲活血軟堅散結(jié)，蒲黃、姜黃活血行氣止痛，諸藥和之，既能祛邪清熱解毒，又能利濕化瘀止痛，寒溫并用，標(biāo)本兼顧。

本實驗數(shù)據(jù)表明模型組子宮組織光鏡下可見炎性因子大量浸潤和組織增生，血清IL-2、TNF-α水平升高明顯，藥物干預(yù)后，子宮組織形態(tài)等到改善且IL-2、TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），一來說明CPID模型制備成功，二來說明藥物治療有效。婦科千金膠囊是目前治療盆腔炎性疾病公認的中成藥，特別是慢性盆腔炎，本研究觀察到甲連盆腔膠囊有與之相似甚至更好的抗炎作用，這可能與婦科千金膠囊用藥療程和單獨用藥有關(guān)。

甲連盆腔膠囊可能通過降低CPID大鼠體內(nèi)炎性因子水平，減輕局部炎癥反應(yīng)，促進受損組織修復(fù)，從而達到治療CPID的作用，值得進一步推廣和研究。