關(guān)于滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定研究

代嬌 宋秋玲 田甜

摘要：采用實(shí)驗(yàn)分析的方法，依靠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了滇重樓的真菌抗菌活性及其菌株鑒定結(jié)果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，滇重樓中的金黃色葡萄球菌具有理想的抗菌活性，并且菌株鑒定結(jié)果顯示，該菌株為墻粘鞭霉，因此應(yīng)該得到相關(guān)人員的關(guān)注。

關(guān)鍵詞：滇重樓;內(nèi)生真菌抗菌活性;菌株鑒定

前言：

滇重樓是一種廣泛分布于云南、貴州等地區(qū)的藥材，其根莖可以用藥，具有良好的清熱解毒、消腫止痛的功能，在臨床上常被用于治療咽喉腫痛、毒蛇咬傷等癥狀，其效果顯著。內(nèi)生真菌是指生活在植物組織內(nèi)部而不影響植物組織明顯癥狀的真菌，內(nèi)生真菌可以分泌毒素或者抗菌物質(zhì)，影響了藥物的臨床應(yīng)用。

1.實(shí)驗(yàn)與材料分析

1.1原材料的選擇

在本次研究中，選取10株滇重樓為研究對(duì)象，所選藥物均為當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)與生物技術(shù)學(xué)院保存的菌種。

本次研究中的培養(yǎng)基為：PDA（馬鈴薯培養(yǎng)基）、NB（牛肉蛋白胨培養(yǎng)基）與固體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2對(duì)原材料的處理

將本組10株滇重樓發(fā)酵物用95%乙醇浸泡之后，超聲處理30min，并用紗布做好過(guò)濾;之后取菌絲體，將其加入到80%的丙酮中進(jìn)行浸泡處理，在經(jīng)真空泵抽取之后，做好過(guò)濾。此時(shí)向?yàn)V液中添加100ml的乙醇乙酯，之后萃取乙酸乙酯層，并將其與萃取液合并在一次。之后萃取液在經(jīng)過(guò)40℃的減壓蒸餾之后，可以干燥處理，這樣就能獲得粗提取物浸膏。最后，提取100mg的提取物浸膏，并通過(guò)1ml無(wú)水乙醇完全溶解之后，將最終處理的后獲得的抗菌實(shí)驗(yàn)樣品為實(shí)驗(yàn)品。

1.3發(fā)酵物的抗菌活性檢測(cè)

采用濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行發(fā)酵物的抗菌活性檢測(cè)，將試菌培養(yǎng)液均勻涂抹在抗菌實(shí)驗(yàn)樣品上，之后在NB平板上的適當(dāng)位置粘貼蘸取了待測(cè)菌種發(fā)酵物乙醇提取物的濾紙片，同時(shí)選取100μg/ml無(wú)菌水與青霉素進(jìn)行對(duì)照，在37℃環(huán)境下來(lái)培養(yǎng)1d時(shí)間，觀(guān)察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，并按照交叉法來(lái)測(cè)量抑菌圈的變化，評(píng)估抑菌效果。

1.4抗菌活性菌株鑒定

在本次研究中，為了能夠獲得更理想的抗菌活性菌株鑒定結(jié)果，需要對(duì)具有較高抑菌活性的真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定，這樣就能確定具體的抗菌活性水平。之后在對(duì)菌株的活性鑒定過(guò)程中，通過(guò)PDA培養(yǎng)基進(jìn)行插片，并按照分離后獲得的滇重樓植物內(nèi)生真菌的形態(tài)特征資料，并將最終的分析結(jié)果來(lái)進(jìn)行分屬鑒定。

2.對(duì)滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選和菌株鑒定結(jié)果的分析

2.1內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性分析

在按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之后，對(duì)內(nèi)生真菌的抗菌活性情況進(jìn)行了分析，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在本次所選擇的10株滇重樓中，由三株無(wú)抗菌活性，而另外7株只對(duì)黃金色葡萄球菌具有一定的抑制作用，并且對(duì)大腸桿菌與產(chǎn)氣腸桿菌無(wú)抑制作用，詳細(xì)資料如表1所示。

2.2抗菌活性的內(nèi)生真菌形態(tài)鑒定

在對(duì)抗菌活性的內(nèi)生真菌形態(tài)進(jìn)行鑒定之后，鑒定結(jié)果顯示，滇重樓菌株屬于粘鞭霉屬，這種真菌的主要特征為：培養(yǎng)過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)菌絲束，并且外表呈現(xiàn)出白色，且分生孢子聚集之后，其顏色相對(duì)暗（相關(guān)資料見(jiàn)圖1）。

2.3抗菌活性的內(nèi)生真菌分析鑒定

鑒定結(jié)果顯示，真菌中的PCR擴(kuò)增條帶具有亮度高、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，并且在對(duì)真菌的規(guī)格進(jìn)行分析之后，發(fā)現(xiàn)大部分真菌的大小為500-700bp。根據(jù)這一結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，本次研究中擴(kuò)增出的序列可能為ITS序列，因此可以采用測(cè)序分析的方法類(lèi)來(lái)進(jìn)行內(nèi)生真菌分析鑒定。之后，按照這一要求技術(shù)人員將測(cè)序的結(jié)果提交給GenBank，之后獲得具體的登入號(hào)。

2.4對(duì)分析結(jié)果的深入研究

滇重樓內(nèi)生真菌的活性篩選與菌株鑒定具有特異性，這一點(diǎn)在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，確實(shí)伴隨大量?jī)?nèi)生真菌共生的情況，其中依然可以發(fā)現(xiàn)大量與宿主相同或者基本相似的生物活性物質(zhì)[1]。對(duì)于相關(guān)人員而言，必須要正確認(rèn)識(shí)到滇重樓的藥用價(jià)值，該藥物的根莖中含有足夠的甾體化合物，從臨床應(yīng)用情況來(lái)看，滇重樓具有理想的抗微生物、止血等作用。

結(jié)論：

從本次研究結(jié)果可知，滇重樓內(nèi)生真菌抗菌活性具有特殊性，可以帥篩選到了具有抗金黃色葡萄球均活性，并且研究結(jié)果也證明，滇重樓內(nèi)的次生代謝物中含有一定量的抗生素環(huán)孢菌素C，證明滇重樓內(nèi)的抗菌活性水平理想。因此在未來(lái)工作中，需要通過(guò)開(kāi)展深入研究來(lái)判斷其次生代謝產(chǎn)物中的抗菌活性水平，這對(duì)于提高滇重樓的臨床藥用價(jià)值具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]李靜.滇重樓內(nèi)生真菌及其抗菌活性檢測(cè)和甾體化合物分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.