石斛酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

張 梅，李春霞，韋 芳，秦 瑜

0引言

據(jù)世界衛(wèi)生組織保守估計(jì)，至2035年糖尿病患病率將增加55%，由目前的3.82億增加至5.92億[1]。在過(guò)去1980/2010的30a中，經(jīng)過(guò)7次全國(guó)性糖尿病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中國(guó)大陸糖尿病發(fā)病人群增長(zhǎng)了17倍，且糖尿病和糖調(diào)節(jié)異常在中國(guó)已成為了流行病[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病并發(fā)癥之一，在DR的發(fā)病過(guò)程中主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管病變和視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變，視網(wǎng)膜上所有細(xì)胞都會(huì)受到影響，并導(dǎo)致視功能逐漸喪失[3]。石斛是《中國(guó)藥典》歷版所收載的名貴中藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳等功效，來(lái)源于蘭科石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)石斛屬植物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、抗氧化、抗誘變等多種活性[4]，其主要化學(xué)成分為聯(lián)芐類、多糖、生物堿、菲類、芴酮、香豆素和倍半萜等化合物[5]。石斛酚是一種從石斛中提取出的聯(lián)芐類化合物，聯(lián)芐類化合物具有重要的抗腫瘤、抗誘變等生物活性，常被作為衡量石斛藥材質(zhì)量的質(zhì)控指標(biāo)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞及藥物人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs，ACBRI181)購(gòu)自Cell Systems(Kirkland，WA，USA)；石斛酚、依帕司他購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。石斛酚結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.1.2試劑M199培養(yǎng)基、胎牛血清、2.5g/L胰蛋白酶、青-鏈霉素混合液購(gòu)自Gibco公司；ROS活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物；一抗NF-κB(ab32536)購(gòu)自Abcam公司，β-actin(60008-1-lg)購(gòu)自Proteintech公司；二抗羊抗兔(111-035-003)購(gòu)自Jackson公司；Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，熒光定量PCR檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)，紫外分光光度計(jì)(上海司樂(lè)儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理使用含10%胎牛血清的M199低糖培養(yǎng)基(葡萄糖5.5mmol/L)，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每2～3d換液一次。實(shí)驗(yàn)分為5組：正常組(葡萄糖5.5mmol/L，NG)、甘露醇組(葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L，M)、高糖組(葡萄糖30mmol/L，HG)、石斛酚組(葡萄糖30mmol/L+石斛酚5μmol/L，GIG)、依帕司他組(葡萄糖30mmol/L+依帕司他1μmol/L，EPS)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均培養(yǎng)48h。

1.2.2MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力MTS細(xì)胞毒性與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒是用于測(cè)定細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度、無(wú)放射性的比色檢測(cè)法。HRMECs種植在96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，約1×104個(gè)細(xì)胞。將石斛酚及依帕司他在糖濃度為5.5mmol/L的培養(yǎng)基中設(shè)置出一系列濃度梯度組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h或48h。然后每孔加入20μL的MTS試劑，37℃孵育2h，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度(OD)值。細(xì)胞活性=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3ROS檢測(cè)活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)的試劑盒。HRMECs種植在6孔培養(yǎng)板中，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)70%融合狀態(tài)后，將實(shí)驗(yàn)分為正常組、甘露醇組、高糖組和石斛酚組4組，孵育48h，然后去除培養(yǎng)基，在避光條件下用無(wú)血清培養(yǎng)基按照1∶1000稀釋DCFH-DA，每孔不少于1mL，置于37℃孵育30min。收集細(xì)胞，用PBS清洗3次，將細(xì)胞重懸于300μL預(yù)冷的PBS中，送流式細(xì)胞儀，使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞ROS的活性。

圖1石斛酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)各組細(xì)胞處理結(jié)束后，采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)D260/280的值，估算RNA的純度，并測(cè)RNA濃度，計(jì)算RNA含量，將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)醛糖還原酶(aldose reductase，AR)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的基因表達(dá)情況。引物序列：AR前鏈：GTC CAA AGG CAT CGT GGT GA；后鏈：AGC AAT GCG TTC TGG TGT CA；HIF-1α前鏈：TGC TTG GTG CTG ATT TGT GA；后鏈：GGT CAG ATG ATC AGA GTC CA; VEGF 前鏈：AAG GAG GAG GGC AGA ATC AT；后鏈：ATC TGC ATG GTG ATG TTG GA；β-actin前鏈：GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG；后鏈：AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG。反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃ 30s)，PCR反應(yīng)(95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán))，溶解曲線(95℃ 15s，60℃ 60s, 95℃ 15s)。結(jié)果處理：△Ct=Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對(duì)照組，以 2-△△Ct值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Westernblotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測(cè)核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的蛋白表達(dá)，正常組、甘露醇組、高糖組、石斛酚組、依帕司他組細(xì)胞處理結(jié)束后，用PBS洗3次，RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。定量20μg上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳100mV恒壓，70mV恒壓轉(zhuǎn)模，封閉，加一抗NF-κB(1∶5000)，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG室溫孵育。TBST洗膜后ECL顯影曝光。用Image J軟件分析，并計(jì)算各組光密度與β-actin光密度的比值，分析蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞遷移與修復(fù)能力的實(shí)驗(yàn)。HRMECs種植在12孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)90%融合狀態(tài)后，在每孔中均勻地劃出十字空隙，分為正常組、甘露醇組、高糖組和石斛酚組4組，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48h。在倒置顯微鏡下分別在藥物開始處理后的0、24、48h拍照，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移面積，并計(jì)算細(xì)胞的愈合率，愈合率=(處理后面積-0h面積)/0h面積×100%。

圖2石斛酚對(duì)細(xì)胞活性的影響A：不同濃度石斛酚作用于細(xì)胞24h；B：0～20μmol/L的石斛酚作用于細(xì)胞48h；C：0～10μmol/L的依帕司他作用于細(xì)胞48h。aP<0.05vs對(duì)照組。

圖3高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)A：流式儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組ROS的表達(dá)活性；B：各實(shí)驗(yàn)組ROS的平均熒光強(qiáng)度，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

2結(jié)果

2.1石斛酚對(duì)細(xì)胞活性的影響MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2A顯示，一系列濃度梯度的石斛酚作用于HRMECs 24h，各組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.860，P=0.574)。選取0～20μmol/L石斛酚孵育細(xì)胞48h，結(jié)果見圖2B，各組細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.321，P=0.015)。20μmol/L石斛酚組與對(duì)照組比較，20μmol/L石斛酚組細(xì)胞活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.959，P=0.003)；1～10μmol/L石斛酚組與對(duì)照組比較，5μmol/L石斛酚組細(xì)胞活性最高，其活性與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.135，P=0.895)。依帕司他孵育HRMECs 48h，MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2C，各組細(xì)胞活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.225，P=0.002)，10μmol/L依帕司他組與對(duì)照組比較，10μmol/L依帕司他組細(xì)胞活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.587，P<0.001)，0.1～1μmol/L依帕司他組與對(duì)照組比較，1μmol/L依帕司他組細(xì)胞活性最高，其活性與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.096，P=0.366)。

2.2石斛酚對(duì)氧化應(yīng)激的影響各組ROS的熒光強(qiáng)度分布，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=233.844，P<0.001)。高糖組與正常組比較，高糖組ROS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.888，P<0.001)；石斛酚組與高糖組比較，石斛酚組ROS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.342，P<0.001)。甘露醇組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.131,P=0.898),見圖3。

2.3石斛酚對(duì)AR/NF-κB的調(diào)控圖4A是AR在5組實(shí)驗(yàn)組中的mRNA表達(dá)結(jié)果，各組AR mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.459，P=0.025)，高糖組與正常組比較，高糖組AR表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.596，P=0.005)；石斛酚組、依帕司他組與高糖組比較，石斛酚組與依帕司他組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(石斛酚組：t=3.178，P=0.01；依帕司他組：t=3.369，P=0.007)。圖4B、C是5組Western blotting結(jié)果，各組NF-κB蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.220，P<0.001)，高糖組與正常組比較，高糖組NF-κB表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.916，P<0.001)；石斛酚組、依帕司他組與高糖組比較，石斛酚與依帕司他組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(石斛酚組：t=8.503，P<0.001；依帕司他組：t=7.483，P<0.001)。甘露醇組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(AR表達(dá)t=0.495，P=0.631；NF-κB表達(dá)t=1.417，P=0.187)。

2.4石斛酚對(duì)HIF-1α和VEGF的調(diào)控圖5顯示的是石斛酚對(duì)細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α表達(dá)：F=4.263，P=0.029；VEGF表達(dá)：F=39.936，P<0.05)。高糖組與正常組比較，高糖組HIF-1α和VEGF的表達(dá)都明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α表達(dá)：t=3.112，P=0.011；VEGF表達(dá)：t=9.877，P<0.05)；石斛酚組與高糖組比較，石斛酚組HIF-1α和VEGF的表達(dá)都明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α表達(dá)：t=3.801，P=0.003，VEGF表達(dá)：t=8.051，P<0.05)，甘露醇組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HIF-1α表達(dá)：t=0.443，P=0.667；VEGF表達(dá)：t=1.405，P=0.198)。

圖4石斛酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的AR/NF-κB的調(diào)控A：AR mRNA的表達(dá)水平；B：Western blotting法檢測(cè)高糖下內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)水平；C：NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

圖5采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HIF-1α和VEGFmRNA的表達(dá)A：HIF-1α mRNA的表達(dá)；B：VEGF mRNA的表達(dá)。aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

圖6石斛酚對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響A：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移能力(×100)；B：24、48h各組細(xì)胞愈合率比較，aP<0.05vs正常組；cP<0.05vs高糖組。

2.5石斛酚對(duì)細(xì)胞遷移的影響為探究石斛酚對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，用細(xì)胞的愈合率反映其遷移能力。圖6A是各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在藥物作用后0、24、48h的位置，可看到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞也在生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)的速度不同。圖5B是對(duì)各組細(xì)胞的愈合率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組的愈合率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24h：F=15.926，P=0.001；48h：F=5.493，P=0.024)。高糖組細(xì)胞在24h和48h時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)都是快于正常組的，但只有24h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24h：t=5.374，P=0.001；48h：t=2.136，P=0.065)。且石斛酚組細(xì)胞在24h和48h時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)都明顯慢于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24h：t=4.337，P=0.002；48h：t=3.006，P=0.017)。甘露醇組與正常組在24h和48h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24h：t=1.054，P=0.323；48h：t=1.724，P=0.123)。

3討論

代謝異常致血糖升高，而ROS累積會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而損害視網(wǎng)膜血管，最終發(fā)展為DR。據(jù)研究，高糖血癥損害血管主要通過(guò)四條經(jīng)典途徑：(1)多元醇代謝途徑；(2)晚期糖基化終末產(chǎn)物途徑；(3)蛋白激酶C的激活途徑；(4)氨基己糖的激活途徑。這些途徑都與ROS的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān)，而DR會(huì)誘導(dǎo)ROS生成。氧化應(yīng)激能激活相關(guān)細(xì)胞信號(hào)分子，從而增加基因表達(dá)和改變酶的功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能受損，如內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、周細(xì)胞凋亡、血視網(wǎng)膜屏障功能受損、滲透性過(guò)高、黃斑水腫、異常新生血管等表現(xiàn)[6-7]。

多元醇通路在DR的發(fā)展中起重要作用，而AR是多元醇通路的關(guān)鍵限速酶。AR廣泛存在于腎臟、血管、晶狀體、視網(wǎng)膜、心臟、骨骼肌等組織器官中，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為不易通透細(xì)胞膜的山梨醇，使細(xì)胞腫脹、變性、壞死，與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[8]。研究發(fā)現(xiàn)，石斛酚可作用于AR。石斛酚能延遲晶狀體混濁，保持晶狀體的透明度，具有抗?jié)B透壓和抗氧化的能力，在糖尿病性白內(nèi)障的治療中起重要作用[9]。此外，石斛酚可抑制NF-κB通路，減少RAW264.7巨噬細(xì)胞中由脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶-2的產(chǎn)生[10]。

本研究用30mmol/L葡萄糖建立高糖模型，模擬DR在體內(nèi)的發(fā)病過(guò)程。為防止高滲環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響，特設(shè)置甘露醇組，保持與高糖組相同的滲透壓環(huán)境。石斛酚作為一種從傳統(tǒng)中草藥石斛中提取的單體，已被證實(shí)可作用于AR，但是未在DR中做過(guò)有關(guān)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究。本實(shí)驗(yàn)使用HRMECs，可能在病理特征方面更加貼近DR的實(shí)際病理變化，便于得出更為接近臨床的實(shí)際研究結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)，依帕司他作為一種醛糖還原酶抑制劑，能通過(guò)多元醇通路減少2型糖尿病患者紅細(xì)胞中某些氧化應(yīng)激標(biāo)志物，達(dá)到治療糖尿病及其并發(fā)癥的目的[11]。本實(shí)驗(yàn)中使用石斛酚作用于高糖環(huán)境下的細(xì)胞，依帕司他作為陽(yáng)性對(duì)照，擬探究石斛酚在DR中是否可以像在糖尿病性白內(nèi)障中一樣，通過(guò)抑制AR發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與高糖組相比，石斛酚與依帕司他都可減少HRMECs中AR mRNA的表達(dá)，NF-κB的蛋白表達(dá)量也呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明石斛酚可能會(huì)通過(guò)抑制AR/NF-κB通路起到治療DR的作用。此外，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示，甘露醇組與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明30mmol/L的高滲狀態(tài)并未對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。

DR是最常見的視網(wǎng)膜血管病，微血管細(xì)胞受損導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧，從而產(chǎn)生新生血管，HIF-1α是新生血管形成過(guò)程中的關(guān)鍵因子[12]。HIF-1α作為缺氧反應(yīng)中的一個(gè)調(diào)節(jié)因子，在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)有明顯缺血改變前，視網(wǎng)膜上HIF-1α的表達(dá)已增加，HIF-1α表達(dá)越多表明視網(wǎng)膜缺血缺氧的情況越嚴(yán)重[13]。HIF-1α可誘導(dǎo)VEGF激活，而VEGF與新生血管的形成有重要關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明，削弱氧化應(yīng)激中ROS的產(chǎn)生，可抑制HIF-1α/VEGF 通路激活，從而減少新生血管生成[14]。本研究中熒光探針DCFH-DA結(jié)果顯示，石斛酚可明顯減少HRMECs中ROS的表達(dá)，同時(shí)其下游的HIF-1α/VEGF通路表達(dá)也受到抑制，HIF-1α和VEGF的mRNA表達(dá)明顯降低，說(shuō)明石斛酚可改善高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜缺血缺氧的狀態(tài)，在對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)方面有顯著效果，并且可能有助于減少DR中新生血管的形成。

綜上所述，本研究通過(guò)探討石斛酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中AR通路和氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)石斛酚能抑制HRMECs中的AR通路和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能對(duì)抗VEGF的表達(dá)，減少新生血管形成，為臨床治療DR提供了重要的理論依據(jù)，但是要將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)為臨床成果還需進(jìn)一步的研究。