馬來酸依那普利葉酸片對糖尿病大鼠發(fā)生對比劑腎病的影響及初步機制研究

侯建同，鄢高亮，王棟，喬勇，朱伯謙，劉波，羅二飛，湯成春

對比劑腎?。–IN）是冠心病患者行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）后出現(xiàn)的一種常見并發(fā)癥，其顯著延長患者住院時間、增加術(shù)后死亡率，直接影響預(yù)后[1]。在一般人群中，CIN的發(fā)生率約為2%，而在合并有糖尿病、慢性腎損害及高齡等高危因素的患者中發(fā)生率可高達(dá)20%～30%[2，3]。目前對于CIN的防治缺乏積極有效的措施。因此，尋找到一種有效的治療手段用于合并有糖尿病這種高危因素的CIN患者尤為重要。

馬來酸依那普利葉酸片（EF）是一種含有依那普利及葉酸的新型復(fù)方制劑，是第一種用于治療伴有同型半胱氨酸（Hcy）升高高血壓的藥物。在糖尿病腎病、免疫球蛋白A（IgA）腎病及衰老腎中均有整合素連接激酶（ILK）表達(dá)異常，其與腎功能不全進(jìn)展密切相關(guān)[4，5]。在糖尿病腎病大鼠中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）類藥物可通過降低ILK水平發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[6]。Marti等[7]研究顯示，Hcy水平與慢性腎臟?。–KD）患者腎功能進(jìn)展密切相關(guān)。葉酸可通過降低Hcy水平發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，EF對糖尿病大鼠具有腎臟保護(hù)作用，但其具體機制尚未得知。在本研究中，我們通過觀察EF對腎臟的生化指標(biāo)、病理損傷、凋亡及ILK表達(dá)的影響，探討EF對糖尿病大鼠發(fā)生CIN的腎臟保護(hù)作用及其初步機制，為臨床防治CIN提供新思路。

1 材料與方法

動物：清潔級健康6周齡雄性SD大鼠32只，平均體重（200±20）g，置于東南大學(xué)實驗動物中心，以恒溫22℃～25℃，恒濕（55±5）%,日照12 h，給予自由進(jìn)食進(jìn)水適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于實驗。本實驗方案經(jīng)東南大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

主要儀器與材料：自動生化分析儀AU5800 （美國Beckman Coulter公司），Eclipse 55i光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Nikon公司 ），Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司），EF（深圳奧薩制藥有限公司），鏈脲佐菌素、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛、大鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）ELISA試劑盒（美國Sigma公司），碘普羅胺（德國Bayer公司），小鼠抗大鼠ILK多克隆抗體（美國 Santa Cruz公司），大鼠ILK ELISA試劑盒、兔抗小鼠IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），原位末端標(biāo)記法（TUNEL）染色試劑盒（瑞士Roche公司）。

動物分組與給藥方法：32只雄性SD大鼠依照隨機數(shù)字表法分為4組，每組8只。分別為：對照組,對照+EF組, CIN組, CIN+EF組。大鼠空腹12 h后，CIN組及CIN+EF組通過腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg）建立早期糖尿病模型。對照組和對照+EF組腹腔內(nèi)注射等劑量檸檬酸緩沖液。每天檢測大鼠血糖水平，3天后檢測血糖水平超過300 mg/dl 提示糖尿病模型建立成功。糖尿病模型建立成功后，對照+EF組及 CIN+EF組以 EF [30 mg/2.4 mg/（kg·d）]連續(xù)灌胃7天，對照組和CIN組以等量生理鹽水連續(xù)灌胃7天。

CIN模型建立：灌胃7天后首日建立CIN模型，CIN組及CIN+EF組通過尾靜脈依次注射吲哚美辛（10 mg/kg），L-NAME（10 mg/kg，注射2次，間隔15 min）,碘普羅胺（10 ml/kg）建立大鼠CIN模型[9]。對照組和對照+EF組尾靜脈內(nèi)注射等劑量生理鹽水。建立CIN模型2天后處死4組大鼠。抽取各組大鼠血清，測定相關(guān)生化指標(biāo)。提取腎臟進(jìn)行腎臟病理學(xué)檢查，觀察腎臟細(xì)胞凋亡水平及ILK表達(dá)情況。

生化指標(biāo)測定：通過右心室穿刺取血3 ml，1 580×g離心10 min，取上清液迅速放入-80℃冰箱保存，24 h內(nèi)使用自動生化分析儀測定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、Hcy水平。使用大鼠AngⅡ及ILK ELISA試劑盒依照試劑盒說明書分別測定大鼠血清AngⅡ和ILK水平。

腎臟病理學(xué)檢查：取出大鼠腎臟，置于磷酸鹽 緩 沖 液（PBS，10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、pH 7.4、137 mmol/L NaCl和 2.7 mmol/L KCl）中洗凈殘存血液，去除筋膜，沿腎臟縱軸切開后迅速置入4%多聚甲醛固定24 h以上。常規(guī)石蠟包埋、切片，隨后二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，行蘇木素伊紅（HE）染色，梯度酒精脫水,二甲苯透明，中性樹脂封片。在光鏡下（×400）隨機選取10個不重復(fù)視野觀察腎臟組織，依據(jù)腎臟損傷評分系統(tǒng)[10]評估損傷程度：0分，正常；1分，輕度腎小管上皮細(xì)胞水腫；2分，輕度出血、中度腎小管上皮細(xì)胞水腫；3分，中度出血及腎小管上皮細(xì)胞水腫；4分，重度腎小管上皮細(xì)胞水腫、壞死斑形成；5分，嚴(yán)重腎小管結(jié)構(gòu)改變及壞死。

TUNEL染色：常規(guī)石蠟包埋切片、脫蠟、PBS浸洗。蛋白酶K工作液預(yù)處理（30 min，37℃），加TUNEL反應(yīng)液孵育（60 min，37℃），隨后過氧化酶（POD）轉(zhuǎn)化劑孵育（30 min，37℃）。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水,二甲苯透明，中性樹脂封片。在光鏡下（×400）隨機選取10個不重疊視野分別記數(shù)凋亡腎臟細(xì)胞數(shù)和腎臟細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行匯總。腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡腎臟細(xì)胞數(shù)/腎臟細(xì)胞總數(shù) 。

蛋白免疫印跡法（Western Blot）: 采用Western Blot檢測腎臟內(nèi)ILK蛋白表達(dá)情況。取出腎臟組織加入裂解液，隨后予以勻漿、離心，測定上清液蛋白濃度。每個泳道中加50 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，隨后以5%的脫脂牛奶封閉60 min。封閉后TBST（10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、150 mmol/L NaCl和 0.05%Tween-20）洗膜，加入小鼠抗大鼠ILK多克隆抗體（1:200），4℃過夜。再次加入兔抗小鼠IgG（1:1000）室溫孵育60 min，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光顯影液顯影曝光。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以ILK蛋白與內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin）的灰度值比作為ILK相對表達(dá)量。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，計量資料采用表示；各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用圖基檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較（表1）

與對照組比，CIN組大鼠Scr水平顯著升高，提示CIN模型建立成功，且BUN、Hcy、ILK及AngⅡ水平顯著升高（P＜0.05）。與對照組比，對照+EF組對 Scr、BUN、Hcy、ILK及 AngⅡ水平無明顯影響（P＞0.05）。與CIN組比，CIN+EF組大鼠Scr、BUN、Hcy、ILK及AngⅡ水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較(n=8，

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較(n=8，

注：EF：馬來酸依那普利葉酸片；CIN：對比劑腎??；Scr：血清肌酐；BUN：尿素氮；Hcy：同型半胱氨酸；ILK:整合素連接激酶；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ。與對照組比*P＜0.05；與CIN組比△P＜0.05

組別 Scr (μmol/L) BUN (mmol/L) Hcy (μmol/L) ILK (ng/ml) Ang Ⅱ (pg/ml)對照組 41.71±8.29 6.45±1.21 9.73±1.47 0.92±0.13 104.62±19.62對照+EF組 40.59±6.18 6.29±1.34 9.23±1.31 0.76±0.09 95.42±12.13 CIN 組 71.64±8.51* 15.16±2.08* 14.64±1.17* 1.35±0.11* 179.70±14.83*CIN+EF組 57.08±4.30*△ 12.38±1.23*△ 11.69±1.16*△ 1.14±0.13*△ 143.91±23.59*△

2.2 各組大鼠腎組織HE染色病理結(jié)果（圖1）

腎臟HE染色顯示，CIN組出現(xiàn)重度腎小管上皮細(xì)胞水腫及嚴(yán)重腎小管結(jié)構(gòu)改變及壞死（如圖1C箭頭所示）。CIN+EF組表現(xiàn)為輕、中度腎小管上皮水腫（如圖1D箭頭所示）。腎臟病理損傷評分顯示：與對照組[（0.30±0.28）分]比，CIN組[（2.34±0.49）分]及CIN+EF組[（1.79±0.38）分]均明顯升高（P均＜0.05）；與對照組比，對照+EF組[（0.3±0.27）分]差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。與CIN組比，CIN+EF組腎臟病理損傷評分明顯降低（P＜0.05）。

2.3 TUNEL染色顯示各組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況（圖2）

腎臟TUNEL染色顯示，CIN組出現(xiàn)大量腎臟凋亡細(xì)胞（如圖2C箭頭所示）。CIN+EF組腎臟凋亡細(xì)胞明顯減少（如圖2D箭頭所示）。腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)顯示：與對照組[（3.5±2.0）%]比，CIN組[（27.4±3.5）%]及 CIN+EF 組 [（17.6±2.1）%]腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯升高（P均＜0.05）；與對照組比，對照+EF組[（3.5±1.7）%]腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與CIN組比，CIN+EF組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

2.4 Western Blot分析各組大鼠腎臟ILK表達(dá)情況（圖3）

與對照組比，CIN組及CIN+EF組大鼠腎臟ILK表達(dá)均明顯升高（P均＜0.05）。與對照組比，對照+EF組大鼠腎臟ILK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與CIN組比，CIN+EF組大鼠腎臟ILK表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色病理結(jié)果(×400)

圖2 TUNEL染色顯示各組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況(×400)

圖3 Western Blot分析各組大鼠腎臟ILK表達(dá)情況

3 討論

CIN是血管內(nèi)應(yīng)用含碘對比劑后出現(xiàn)的一種常見、嚴(yán)重的并發(fā)癥。合并有糖尿病、慢性腎功能不全、高齡、慢性心力衰竭、低血容量等的患者更易發(fā)生CIN[11]，防治應(yīng)更積極。在本實驗中，我們研究了EF對早期糖尿病大鼠發(fā)生CIN時的腎臟保護(hù)作用及其可能的機制。我們證實，在誘導(dǎo)CIN模型前應(yīng)用EF可降低大鼠Scr、BUN、Hcy、AngⅡ、ILK水平，顯著改善大鼠腎臟病理損傷及細(xì)胞凋亡發(fā)生。對糖尿病大鼠發(fā)生CIN具有腎臟保護(hù)作用，其潛在機制可能是通過降低AngⅡ、ILK及Hcy水平發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

ILK是整合素通路的關(guān)鍵激酶，是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用的效應(yīng)器,在腎臟固有細(xì)胞信號傳導(dǎo)中，ILK的表達(dá)及活性變化，與細(xì)胞黏附、ECM積聚及細(xì)胞形態(tài)改變密切相關(guān)，在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12]。在高糖等因素刺激下，腎小球系膜細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、AngⅡ等因子，引起ILK水平表達(dá)增高進(jìn)而引起腎臟損傷[13]。且AngⅡ水平增加可促進(jìn)腎臟血管收縮，引起腎臟缺血，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟功能受損。在本研究中，EF可改善CIN大鼠腎臟的損傷程度。我們推測其機制可能是依那普利通過抑制AngⅡ合成，進(jìn)而舒張腎臟血管、降低ILK表達(dá)從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

CIN的發(fā)病機制尚未完全闡明，其發(fā)生機制可能為：腎臟血管收縮、炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮損傷及凋亡[1，14-16]。研究顯示，AngⅡ可促進(jìn)生長因子和促纖維化細(xì)胞因子生成從而促進(jìn)活性氧簇（ROS）合成[17]。產(chǎn)生過多的ROS可直接引起內(nèi)皮功能障礙、腎小管損傷及輸送功能障礙，從而促進(jìn)CIN的發(fā)生[18]。在高糖環(huán)境下引起的氧化應(yīng)激可直接引起腎臟足細(xì)胞損傷，并激活足細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS，進(jìn)一步加重對足細(xì)胞的損傷[19，20]。氧化應(yīng)激使足細(xì)胞作為腎小球濾過膜的基本結(jié)構(gòu)遭受破壞，從而促使CIN的發(fā)生。血Hcy水平與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[21]，且高Hcy血癥是CKD的潛在危險因素，與其進(jìn)展密切相關(guān)[7]。Hcy水平升高能夠通過促使ROS產(chǎn)生及降低一氧化氮（NO）活性引起氧化應(yīng)激及血管內(nèi)皮功能障礙[22]。我們推測EF可能通過降低AngⅡ、Hcy水平進(jìn)而減少ROS產(chǎn)生發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能作用從而保護(hù)腎臟功能。

凋亡也是CIN發(fā)生的重要原因。有研究顯示[23]，對比劑可通過促進(jìn)ROS形成及內(nèi)源性凋亡途徑引起腎小管細(xì)胞凋亡。高Hcy血癥與發(fā)生細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Hcy可通過促進(jìn)ROS合成及抑制NO合成引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。中國卒中一級預(yù)防試驗（CSPPT）[24]顯示，在合并有高血壓及輕到中度CKD患者中，與單用依那普利相比，服用依那普利葉酸片可顯著降低CKD的進(jìn)展。其機制可能是葉酸通過降低Hcy水平從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。高糖等因素可使小鼠足細(xì)胞局部腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)激活，進(jìn)而使AngⅡ表達(dá)上調(diào)，從而引起足細(xì)胞發(fā)生凋亡，使其數(shù)目減少[25]。足細(xì)胞作為腎小球濾過膜的正常結(jié)構(gòu)因其數(shù)目減少造成腎小球濾過膜不可逆性損傷從而促進(jìn)了CIN的發(fā)生。在本研究中，EF可抑制CIN細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是通過抑制AngⅡ合成及降低Hcy水平發(fā)揮作用。

本研究存在諸多不足之處，我們沒有檢測大鼠內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激指標(biāo)。建立的早期糖尿病模型也無法全面模擬臨床上的糖尿病患者。本研究證實，EF對糖尿病大鼠發(fā)生CIN具有保護(hù)作用。其作用機制可能為通過抑制AngⅡ合成從而使ILK表達(dá)下調(diào)，減輕足細(xì)胞的損傷,維持腎小球濾過膜的正常結(jié)構(gòu)。另一方面可能是通過降低Hcy水平協(xié)同發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能、抗凋亡作用，這為探討防治CIN提供了新的途徑。