轉(zhuǎn)GbVe1基因在棉花基因組中的整合與定位分析

陳天子，凌溪鐵，楊郁文，張保龍

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014）

自從1997年我國(guó)審定第一個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉后，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用已達(dá)20余年，累計(jì)推廣面積超過3 000萬hm2，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[1]。伴隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的持續(xù)擴(kuò)大[2]，轉(zhuǎn)基因作物的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、轉(zhuǎn)基因作物潛在的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)及其安全問題日益受關(guān)注。因此，明確轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)基因分子特征，是加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的保護(hù)和安全監(jiān)管的重要技術(shù)依據(jù)。

轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的分子檢測(cè)可通過基于核酸(如Polymerase chain reaction,PCR等)或蛋白（如Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA等）的系列方法進(jìn)行。其中，PCR技術(shù)因具有高特異性、較高的檢測(cè)靈敏度、較低的檢測(cè)成本等優(yōu)勢(shì)而成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)最常用的方法,尤以轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法的特異性最高。轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)是根據(jù)轉(zhuǎn)化載體T-DNA以及T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的融合序列而建立的PCR檢測(cè)技術(shù)，具有高度特異性。目前已有多個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體的單個(gè)PCR特異性檢測(cè)[3-5]和多重PCR同時(shí)檢測(cè)[6]的報(bào)道。這些研究工作都是建立在棉花轉(zhuǎn)化體有明確的T-DNA側(cè)翼序列的基礎(chǔ)之上。

自抗蟲棉推廣以來，我國(guó)通過生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉安全性評(píng)價(jià)材料已達(dá)2 000多份[1]，但大多數(shù)獲得批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花品種只簡(jiǎn)單介紹導(dǎo)入基因的有限分子信息，并未明確其最初的轉(zhuǎn)化體來源，造成了轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的溯源和監(jiān)管的困難。侯娜等[7]通過hiTAIL-PCR獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉材料06N-119的5’端側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)該側(cè)翼序列與汪巧等[8]采用Genome Walking方法獲得的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉鄂雜棉1號(hào)的5’端側(cè)翼序列完全相同。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鄂雜棉1號(hào)和06N-119的側(cè)翼序列與專利US6893826中公開的MON757轉(zhuǎn)化體序列高度相似，推測(cè)鄂雜棉1號(hào)和06N-119中的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體均來源于MON757轉(zhuǎn)化體[5]。含有cry1Aa基因的轉(zhuǎn)基因棉花在我國(guó)和國(guó)外均未通過安全審批，但孫艾等在我國(guó)棉花商品種子中檢測(cè)出了cry1Aa基因[9]，王葉等隨后通過Genome Walking、長(zhǎng)鏈PCR分離獲得含有cry1Aa基因的棉花轉(zhuǎn)化體NN6的整合結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)序列，并建立特異性檢測(cè)方法[10]。由此可見，我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花的轉(zhuǎn)化體來源及其T-DNA側(cè)翼序列等相關(guān)分子特征信息還有待進(jìn)一步完善。

棉花基因組序列的公布為研究棉花基因功能提供了契機(jī)，也為準(zhǔn)確地鑒定棉花轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。隨著棉花基因功能研究的不斷深入，將有更多的轉(zhuǎn)基因棉花涌現(xiàn)；明確棉花轉(zhuǎn)化體的T-DNA側(cè)翼序列將有助于我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花的良性發(fā)展。在前期研究中，我們利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將表面受體蛋白GbVe1導(dǎo)入了棉花基因組中，獲得了抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花材料[11]。本研究旨在利用hiTAIL-PCR技術(shù)[12]擴(kuò)增轉(zhuǎn)GbVe1基因棉花T-DNA的側(cè)翼序列，明確外源基因在棉花染色體上的插入位點(diǎn)，建立特異性定性PCR檢測(cè)方法，并提供擴(kuò)增含有pCAMBIA2301載體的轉(zhuǎn)化體邊界序列的特異引物，提高棉花轉(zhuǎn)化體的側(cè)翼序列分離效率，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花的安全評(píng)價(jià)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供相關(guān)分子信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

抗黃萎病GbVe1基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花由本實(shí)驗(yàn)室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花子葉和下胚軸而獲得[11]，含有基于pCAMBIA2301載體構(gòu)建的、采用CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GbVe1目的基因過量表達(dá)的植物表達(dá)載體（圖1a）。

Ex-Tap DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、DNA marker、pMD18-T載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；DH5α感受態(tài)菌株等購自北京天根生物技術(shù)有限公司。PCR引物的合成和克隆片段的測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(cè)

取棉花幼葉3～5 g，采用CTAB方法[13]提取棉花基因組DNA，溶解300μL無菌水中。取1μL DNA在1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性，并根據(jù)DNA條帶亮度估算其濃度。然后取棉花基因組DNA 40μg，HindⅢ酶切后，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠低壓電泳并轉(zhuǎn)移到尼龍膜后，用地高辛標(biāo)記的700 bp NPTII探針進(jìn)行雜交。探針標(biāo)記和雜交參照試劑盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche公司）的說明書進(jìn)行。

1.3 hiTAIL-PCR引物

LAD隨機(jī)簡(jiǎn)并引物采用劉耀光等[12]所介紹的引物，LB端的特異引物根據(jù)pCAMBIA2301載體左邊界35S polyA終止子序列設(shè)計(jì)，RB端的特異引物根據(jù)pCAMBIA2301載體右邊界GUS基因和NOS終止子序列設(shè)計(jì)。特異引物使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列及其位置見表1。

1.4 hiTAIL-PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件

hiTAIL-PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參考劉耀光等[12]方法，略有改動(dòng)。第一輪pre-amplification反應(yīng)體系為20μL，包括10.0μL 2×Ex-Tap pre-mix buffer、1.0μL 20μmol·L－1LAD1-1引物、1.0 μL 20μmol·L－1LAD1-3引 物（或1.0μL 20 μmol·L－1LAD1-2引 物、1.0μL 20μmol·L－1LAD1-4引物）、1.0μL 6μmol·L－1RBGUS-2引物（擴(kuò)RB邊 界）（或1.0μL 6μmol·L－1LB35STR-4引物（擴(kuò)LB邊界））、1.0μL 20～30 mg·L－1棉花基因組DNA、5.0μL無菌水。第二輪primary TAIL-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5 μL 2×Ex-Tap premix buffer、1.25μL 6μmol·L－1AC1引物、1.25μL 6μmol·L－1RBGUS-4C引物（擴(kuò)RB邊 界）（或1.25μL 6μmol·L－1LB35STR-3C1引物（擴(kuò)LB邊界））、1.0μL稀釋50倍的Pre-amplification產(chǎn)物、9μL無菌水。第三輪secondary TAIL-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL 2×Ex-Tap premix buffer、1.25μL 6 μmol·L－1AC1引物、1.25μL 6μmol·L－1RB-2a或RB-0a引物（擴(kuò)RB邊界）（或1.25μL 6μmol·L－1LB35STR-2或LB35STR-1引物（擴(kuò)LB邊界））、1.0μL稀 釋10倍的第二輪primary TAIL-PCR產(chǎn)物、9μL無菌水。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers in this study

1.5 側(cè)翼序列獲取和分析

第三輪secondary TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，特異條帶用Axygen Axy Prey DNA Gel Extraction Kit回收純化，回收的PCR片段連接到pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每條片段的轉(zhuǎn)化克隆隨機(jī)挑8個(gè)單克隆菌落，用載體的通用M13引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，隨后取2個(gè)陽性克隆送測(cè)序。

1.6 側(cè)翼序列分析

測(cè)序獲得的序列合并成為FASTA格式文件，利用NCBI vector contamination（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）分析測(cè)序片段中的載體骨架序列，含有T-DNA載體的LB或RB端骨架序列以及未知序列的測(cè)序片段隨后與棉花基因組比對(duì)，從而判斷獲得的未知序列是否屬于插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。本文采取的棉花基因組版本是在phytozome網(wǎng)站picos測(cè)序方法拼裝的陸地棉TM-1基因組，可以視圖化地看出獲得的邊界序列在基因組的位置。

1.7 側(cè)翼序列驗(yàn)證及轉(zhuǎn)化體特異性分析

為了驗(yàn)證T-DNA插入位點(diǎn)的正確性，根據(jù)所獲得的LB、RB邊界側(cè)翼序列和T-DNA區(qū)段內(nèi)的序列設(shè)計(jì)PCR特異引物，以12/100826-393株系T5代植株DNA為模板，特異性擴(kuò)增T-DNA插入序列到其插入位點(diǎn)兩側(cè)的棉花基因組的序列片段，引物序列和位置分別見表1和圖1。

圖1 12/100826-393株系T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列及特異PCR引物的位置示意圖Fig.1 The T-DNA flanking sequences of transgenic line 12/100826-393 and specific primers on the flanking sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 Southern雜交檢測(cè)

如圖2所示，利用內(nèi)切酶HindⅢ酶切消化轉(zhuǎn)基因棉花DNA時(shí)，T-DNA區(qū)段將產(chǎn)生同時(shí)含有NPTII基因、Gbve1基因的6 057 bp（base pair）片段和單含GUS基因的2 938 bp片段；用NPTII探針雜交時(shí)，雜交帶預(yù)期的最小條帶為6 057 bp，故小于marker 5 148 bp的雜交信號(hào)不考慮，有效的雜交信號(hào)位于marker 5 148～21 226 bp之間?？椎?（野生型）和孔道7的樣品未檢出雜交信號(hào)，孔道3、4的樣品呈多拷貝插入，孔道5、6、8、9的樣品呈單拷貝插入。本研究候選孔道6、8、9對(duì)應(yīng)的12/100826-393、7/100826-152、1/w-ch14等3個(gè)株系進(jìn)行后續(xù)T-DNA側(cè)翼序列分析。

圖2 轉(zhuǎn)GbVe1基因棉花的T-DNA載體示意圖及southern blot結(jié)果Fig.2 The T-DNA construct and southern blot of transgenic GbVe1 cotton

2.2 側(cè)翼序列的擴(kuò)增

取第二輪primary TAIL-PCR(一對(duì)引物)和第三輪secondary TAIL-PCR（兩對(duì)引物）擴(kuò)增產(chǎn)物一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)引物組合均可獲取清晰的條帶，且第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物（0a、2a；R2、R1）略小于第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物（4c；3c），第三輪內(nèi)側(cè)巢式引物（2a；R1）的擴(kuò)增產(chǎn)物也略小于外側(cè)巢式引物（0a；R2）的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3），符合預(yù)期。從圖3中可見，hiTAIL-PCR產(chǎn)物有多條帶，但一般僅有一條帶最亮，其中RB側(cè)翼序列擴(kuò)增產(chǎn)生的平均條帶數(shù)為3.1條/反應(yīng)，片段長(zhǎng)度在250～1 300 bp之間，LB側(cè)翼序列擴(kuò)增產(chǎn)生的平均條帶數(shù)為1.7條/反應(yīng)，片段長(zhǎng)度在250～800 bp之間。此外，第一輪采用LAD1-1/LAD1-3的擴(kuò)增體系獲取的最終產(chǎn)物比采用LAD1-2/LAD1-4擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)，尤其是在對(duì)LB側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)尤為明顯。

2.3 側(cè)翼序列的克隆與分析

圖3 hiTAIL-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)GbVe1基因株系的T-DNA邊界序列Fig.3 hiTAIL-PCR results of T-DNA flanking sequences of transgenic GbVe1 cotton

根據(jù)hiTAIL-PCR特異引物位置可知，hi-TAIL-PCR正確擴(kuò)增的產(chǎn)物應(yīng)含有T-DNA序列和棉花基因組序列。本研究共計(jì)回收測(cè)序16條片段（圖2紅色箭頭所示），其中長(zhǎng)度＞500 bp的回收片段10條，含T-DNA序列的片段有9條，hiTAIL-PCR正確擴(kuò)增率90%；長(zhǎng)度≤500 bp的回收片段6條，含T-DNA序列的片段僅有2條，hiTAIL-PCR正確擴(kuò)增率33.33%。共計(jì)11條片段同時(shí)含有T-DNA序列及其旁側(cè)的未知序列（表2）。該11條片段進(jìn)一步與TM-1棉花基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其上的未知序列均能比對(duì)到棉花基因組上，比對(duì)長(zhǎng)度介于119～1 011 bp（表2），表明所獲得的片段即是T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。另有編號(hào)1的片段，其2個(gè)測(cè)序克隆均不含T-DNA序列但含有未知序列，未知序列也能比對(duì)到棉花基因組序列，推測(cè)該片段可能是引物非特異性擴(kuò)增棉花基因組的產(chǎn)物。

2.4 插入位點(diǎn)分析

將12/100826-393株系的側(cè)翼序列與Phytozome網(wǎng)站的TM-1棉花基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其4條RB側(cè)翼序列均源于D01染色體上的53 897 359～53 898 368區(qū)段，2條LB側(cè)翼序列源于D01染色體上的53 896 822～53 897 337區(qū)段（表3），RB和LB側(cè)翼序列間隔21 bp，表明T-DNA插入導(dǎo)致棉花基因組發(fā)生了21 bp堿基的缺失，該插入位點(diǎn)位于Gohir.D01G157600.1內(nèi)含子（圖4）。

以同樣方法對(duì)另外兩個(gè)株系（1/w-ch14、7/100826-152）進(jìn)行插入位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)7/100826-152株系的T-DNA插入位點(diǎn)也同在Gohir.D01G157600.1內(nèi)含子上，推測(cè)這兩個(gè)株系可能是來源于同一個(gè)轉(zhuǎn)化事件。1/w-ch14株系的LB和RB側(cè)翼序列也能定位到Gohir.-D01G157600.1基因上，但另有其它RB側(cè)翼序列（表2的測(cè)序片段2和片段4）唯一地定位到A12染色體Gohir.A12G167400.1和Gohir.-A12G167500.1兩基因間的間隔區(qū)中，推測(cè)該株系可能不是單拷貝插入。

對(duì)12/100826-393株系的T-DNA側(cè)翼序列的AT含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LB側(cè)翼序列的516bp堿基和RB側(cè)翼序列的1 008 bp堿基中的AT含量分別為63.4%和63.7%；對(duì)插入位點(diǎn)所處的基因序列分析，發(fā)現(xiàn)Gohir.D01G157600.1的AT含量為59.5%，說明T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列AT含量較高。

表2 hiTAIL-PCR獲取的轉(zhuǎn)GbVe1基因棉花T-DNA側(cè)翼序列Table 2 T-DNA flanking sequences in transgenic GbVe1 cotton by hiTAIL-PCR

2.5 轉(zhuǎn)化體特異性分析

根據(jù)獲得的側(cè)翼序列和T-DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物（表1、圖1），以12/100826-393株系T5代植株DNA為模板，PCR驗(yàn)證其插入位點(diǎn)的正確性。NOS終止子到RB邊界序列（圖5a）、35S終止子到LB邊界序列（圖5b）、GUS基因到RB邊界序列（圖5c）、NPTII基因到LB邊界序列（圖5c）和T-DNA區(qū)內(nèi)GbVe1基因到NPTII基因的片段（圖5c）都在轉(zhuǎn)基因棉花中擴(kuò)增出了預(yù)期目標(biāo)片段，說明T-DNA插入及其側(cè)翼序列是正確的。進(jìn)一步擴(kuò)增GbVe1基因到RB邊界序列更長(zhǎng)的片段，引物組合Gbvdr-1R＋R4獲得4.8 kb符合預(yù)期大小的特異帶，但條帶較弱；引物組合Gbvdr-1R＋R2（預(yù)期大小4.3 kb）則無擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是由于引物特異性不足。相比之下，引物組合Gbvdr-2F＋S11、Gbvdr-2F＋S21擴(kuò) 增GbVe1基因到LB邊界序列獲得3.5 kb左右的特異帶（圖5d）。非轉(zhuǎn)基因植株（WT）在各個(gè)引物組合下均無任何擴(kuò)增條帶，表明上述引物可以特異性地檢測(cè)T-DNA在Gohir.D01G157600.1內(nèi)含子上的插入事件。

表3 轉(zhuǎn)基因株系12/100826-393的T-DNA側(cè)翼序列與棉花TM-1基因組的blast結(jié)果Table 3 The blast result of T-DNA flanking sequences of transgenic line 12/100826-393 with TM-1 cotton genome

圖4 轉(zhuǎn)GbVe1基因棉花株系12/100826-393的T-DNA及其側(cè)翼序列在基因組的定位示意圖Fig.4 The locations of T-DNA and flanking sequences in the genome of transgenic GbVe1 cotton line 12/100826-393

圖5 PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因株系12/100826-393的T-DNA插入Fig.5 The confirmation of T-DNA insertion in the transgenic line 12/100826-393

3 討論

hiTAIL-PCR是獲取T-DNA側(cè)翼序列的高效方法，在水稻中擴(kuò)增的成功率不低于90%[12]。采用同樣的簡(jiǎn)并引物和反應(yīng)體系，侯娜等[7]成功獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的3’端側(cè)翼序列800 bp，但沒能獲得5’端側(cè)翼序列。這說明hiTAIL-PCR的高擴(kuò)增率一方面得益于LAD簡(jiǎn)并引物的高度簡(jiǎn)并性，另一方面也依賴于錨定在T-DNA上的特異引物的有效性。為了克服單條LAD簡(jiǎn)并引物在棉花上的兼容性不好，且鑒于第一輪pre-amplification反應(yīng)體系混合采用兩條LAD簡(jiǎn)并引物能比單條LAD簡(jiǎn)并引物提高擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)量[12]，本研究采用LAD1-1/LAD1-3或LAD1-2/LAD1-4對(duì)相同的DNA模板進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。此外，為了確認(rèn)hiTAIL-PCR擴(kuò)增的特異性，我們?cè)诘谌唖econdary TAIL-PCR擴(kuò)增時(shí)采用2條巢式引物分別對(duì)第二輪primary TAIL-PCR產(chǎn)物進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增。理論上，hiTAIL-PCR第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物比第二輪產(chǎn)物略小，且采用內(nèi)側(cè)巢式引物擴(kuò)增的第三輪產(chǎn)物比外側(cè)巢式引物擴(kuò)增的第三輪產(chǎn)物也偏小。實(shí)際結(jié)果也符合預(yù)期，3個(gè)株系均能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究hiTAIL-PCR所用的特異引物用在其它含有pCAMBIA2301載體骨架的棉花轉(zhuǎn)化體上也成功獲得了T-DNA側(cè)翼序列，說明這些引物具有較好的特異性，可為含有類似基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化體的T-DNA側(cè)翼序列研究提供借鑒。

本研究hiTAIL-PCR擴(kuò)增RB端和LB端的產(chǎn)物都含有多條帶，這與在水稻中的結(jié)果一致，但水稻中大部分產(chǎn)物大于500 bp，多在1～3 kb[12]。本研究對(duì)hiTAIL-PCR不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆、測(cè)序，結(jié)果表明90%大于500 bp的產(chǎn)物屬于hiTAIL-PCR正確擴(kuò)增的；而小于500 bp的產(chǎn)物只有1/3左右是hiTAIL-PCR正確擴(kuò)增的。所以，hiTAIL-PCR獲取T-DNA側(cè)翼序列時(shí)，盡可能選取大于500 bp的產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。但產(chǎn)物片段也不是越大越好，如本研究的片段1是最大的產(chǎn)物片段，含有能比對(duì)上棉花基因組的未知序列600～1000 bp，但其不含T-DNA序列，無法判斷其是否屬于T-DNA側(cè)翼序列，只能將其歸于非特異擴(kuò)增的產(chǎn)物。

許多研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA整合到基因組有偏好性。左開井等[14]發(fā)現(xiàn)不同來源的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的T-DNA下游側(cè)翼片段為富含AT堿基結(jié)構(gòu),其中泗棉3號(hào)轉(zhuǎn)基因抗蟲品系中下游側(cè)翼片段的AT堿基高達(dá)92%。王曉波等[15]也發(fā)現(xiàn)抗草甘膦EPSPS基因插入的下游側(cè)翼片段為富含AT堿基(71.5%)結(jié)構(gòu)，上游側(cè)翼片段也富含AT堿基（75.3%），且這些區(qū)域的基因密度相對(duì)較低。而李彥龍[16]則發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA整合到棉花基因組的過程中，T-DNA更偏好整合到基因區(qū)或轉(zhuǎn)座子區(qū)域。此外，T-DNA插入通常伴隨著插入位點(diǎn)序列的刪除或復(fù)制、T-DNA序列的部分刪除或復(fù)制、基因組的重排、染色體的易位或倒位等現(xiàn)象[17]。侯娜等[7]發(fā)現(xiàn)Bt抗蟲基因的插入過程中造成了75 bp的棉花基因組片段缺失。在本研究中，T-DNA插入位點(diǎn)位于基因的內(nèi)含子上，插入位點(diǎn)上游和下游序列也富含AT堿基，T-DNA插入的導(dǎo)入造成了插入位點(diǎn)處的21 bp堿基丟失，同時(shí)T-DNA序列的LB端缺失12 bp，RB端缺失44 bp，推測(cè)T-DNA的插入位點(diǎn)可能與基因組中的重組熱點(diǎn)區(qū)域有關(guān)，但有待于更多的材料加以分析和印證。

4 結(jié)論

hiTAIL-PCR獲取了轉(zhuǎn)GbVe1基因棉花的T-DNA側(cè)翼序列，提供了T-DNA插入位點(diǎn)位于Gohir.D01G157600.1基因的內(nèi)含子的特異性的檢測(cè)引物，并提供了適用于含有pCAMBIA2301載體骨架的轉(zhuǎn)化體的hiTAIL-PCR特異引物。