棉花重組自交系鈴重性狀的QTL定位

曲朝陽，賈曉昀，馬啟峰，王寒濤，魏恒玲，范術麗*

（1.中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽455000；2.河北省農林科學院糧油作物研究所，石家莊050035）

鈴重是構成棉花產量的基本因子之一[1]。在穩(wěn)定衣分和單位面積總鈴數的基礎上，若能穩(wěn)步提高鈴重，可進一步提高棉花產量[2]。

鈴重既受品種遺傳控制，也受栽培技術、環(huán)境條件等因素的影響。僅依靠傳統(tǒng)育種定向提高鈴重，不但具有一定的盲目性而且育種周期較長[3]，嚴重制約選育高鈴重材料的進程。近年來，隨著生物技術的快速發(fā)展，分子標記輔助選擇技術在作物育種上的應用研究也日益深入[4-6]。開發(fā)與鈴重相關的分子標記需要尋找有效的數量性狀位點（Quantitative trait loci，QTL）。李成奇等[7]利用F2:3群體定位到2個鈴重QTL，分布于A10和A12染色體，解釋的表型變異率為6.1%～7%。王婷[8]利用F2群體和F2:3群體分別定位到4個和1個鈴重QTL，解釋的表型變異率為2.7%～10.6%；Wu等[9]利用重組自交系（Recombinant inbred lines，RILs）群體定位到3個鈴重QTL，解釋的表型變異率為7.3%～11.7%；Wang等[10]利用180個家系組成的RILS群體定位到5個鈴重QTL，解釋的表型變異率為4.83%～9.66%；Zhang等[11]利用115個家系組成的BC3F2回交群體，在4個環(huán)境下共定位到51個鈴重QTL，解釋的表型變異率為1.02%～13.23%；Fan等[12]利用143個家系組成的RILS群體，在3個環(huán)境下共定位到10個鈴重QTL，解釋的表型變異率為0.97%～19.77%；Yu等[13]利用146個家系組成的BC2F4回交群體，在4個環(huán)境下共定位到10個鈴重QTL，解釋的表型變異率為8.48%～25.27%；Zhang等[14]利用196個家系組成的RILS群體，在11個環(huán)境下共定位到146個鈴重QTL，分布于25條染色體，最高可解釋的表型變異率為16.70%。這些QTL為分析鈴重遺傳機理提供了依據。同時，利用與鈴重QTL緊密連鎖的遺傳標記，并結合田間表型數據進行分子標記輔助選擇育種，能有效減少連鎖累贅，提高對鈴重選擇的準確性，這對提高棉花產量育種的效率意義重大。

本研究以分辨率高、重復性好的RILs為作圖群體，構建以SNP（Single nucleotide polymorphisms）為主要標記的遺傳連鎖圖譜，結合田間多年的鈴重數據，檢測與鈴重相關的主效QTL，以期為棉花高產育種提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 親本及作圖群體

本研究以陸地棉品種中棉所36為母本、海島棉染色體片段漸滲系材料G2005為父本配制雜交組合，2006年于河南安陽（AY）經去雄、授粉，收獲F1種子，當年冬天于海南加代、自交；2007年于安陽種植F2，通過連續(xù)多代自交，于2010年構建成包含137個株系的F2:9RILs群體[15]。2011―2015年連續(xù)5年在安陽種植，采用完全隨機區(qū)組設計，設3次重復，單行區(qū)，行長4 m，行距0.8 m，株距20 cm，田間種植均按照農場標準化管理。

1.2 遺傳連鎖圖譜的構建

采集雙親及137個株系幼嫩葉片，采用CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide）法[16]提取DNA，送至深圳華大基因，采用RAD-seq（Restriction-site associated DNA sequencing）測序技術對親本及群體進行100 bp的雙末端測序[17-18]；篩選親本間的SNP，結合楊繼龍[15]篩選的SSR標記，采用HighMap策略進行遺傳圖譜構建[19]。

1.3 數據分析及QTL定位

吐絮盛期，在取樣行采摘50個正常吐絮的中上部棉鈴，曬干稱重，3個重復的平均值為當年鈴重數據。用Excel 2007對群體的鈴重進行基本統(tǒng)計分析，包括均值、最大值、最小值、方差、變異系數、峰度、偏度等。利用WinQTLCart 2.5軟件和復合區(qū)間作圖法[20]進行QTL定位及多環(huán)境均值聯(lián)合分析，窗口大小為5 cM，步長為1 cM，背景標記為10個，LOD值為2.5。以下模式為QTL命名的標準[21]：q＋性狀名稱英文縮寫＋染色體序號＋QTL編號。如qBW-A3-1表示位于A3染色體的第1個控制鈴重的QTL。

2 結果與分析

2.1 親本及群體性狀的表型分析

5個環(huán)境下分別選取親本及RILs群體株系的優(yōu)質棉鈴，稱重并統(tǒng)計。結果表明5個環(huán)境下兩親本的鈴重差異均顯著或極顯著（表1），為鈴重QTL的分子標記篩選提供較好的遺傳基礎。不同年份群體平均值表現不同的分離模式，高于或低于低值親本。5個環(huán)境下，137個株系中所獲得的鈴重數據有較大波動，除2014年安陽鈴重的峰度外，偏度及峰度的絕對值都小于1，基本符合正態(tài)分布（圖1），這表明鈴重受微效多基因控制，符合數量性狀遺傳模型，可以用來進行QTL定位研究。在RILs群體中，鈴重表現明顯的雙向超親分離現象，最大值均高于高值親本，說明分離群體中含有高鈴重材料，可以通過聚合育種或分子標記輔助選擇育種選育高鈴重品種。

表1 5個環(huán)境下重組自交系群體及親本的鈴重表現Table 1 Boll weight of RILs population and their parents in five environments

圖1 2011―2015年RILs群體鈴重分布圖Fig.1 Distribution of boll weight of RILs population in five environments

2.2 遺傳圖譜構建

親本中棉所36和G2005測序深度分別為6.43×和10.57×，Q30值分別達到89.75%和90.95%；重組自交系群體平均每個株系測序深度約4.59×，Q30值為86.38%。通過與陸地棉參考基因組比對[22]，共得到369 223個SNP，其中親本間的多態(tài)性SNP有78 127個，多態(tài)性比例達到21.16%[23-24]。結合多態(tài)性SSR（Simple sequence repeat）標記[15]，構建1張包含6 434個位點的高密度遺傳圖譜（表2），圖譜中包含6 295個SNP標記和139個SSR標記，總遺傳圖距為4 071.98 cM，標記間平均距離為0.63 cM，標記間最大距離為18.24 cM，是目前陸地棉種內標記密度最大的圖譜之一[25-26]。

2.3 鈴重性狀的QTL定位

5個環(huán)境共檢測到32鈴重QTL（表3，圖2）。其中，能在不同年份被檢測到的有5個，分別為qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D9-1和qBW-D9-2。qBW-A4-1在2013年和2015年均被檢測到，加性效應值為－0.14～－0.15，解釋的表型變異率為5.07%～9.79%。qBW-A5-2在2011年和2012年均被檢測到，加性效應值為－0.12～－0.15，解釋的表型變異率為6.32%～7.73 %；qBW-A4-2在2011年和2012年均被檢測到，加性效應值為－0.20～－0.29，解釋的表型變異率均達到15.8%，增效基因都來自高值親本G2005，可能為多環(huán)境下較為穩(wěn)定的主效QTL；qBW-D9-1和qBW-D9-2在2013年和2014年均被檢測到，加性效應值分別為－0.13～－0.14和－0.13，解釋的表型變異率依次為6.73%～7.35%和5.52%～6.78%。多數檢測到的QTL為主效QTL，說明鈴重可能受主基因和微效多基因共同控制。在所檢測的QTL中，26個來自父本G2005，占81.3%；6個來自母本中棉所36，占18.7%。由于高代RILs群體后代趨于純合，顯性及與顯性相關的上位性隨著同質性的增加逐漸消失，遺傳效應主要表現為加性效應[27]。

表2 遺傳圖譜詳細信息統(tǒng)計Table 2 Detail information of the genetic map

表3 5個環(huán)境中檢測到的鈴重QTLsTable 2 Detection of QTLs associated with boll weight in five different environments

圖2 鈴重QTL定位結果Fig.2 The results of QTL mapping for boll weigh

圖2 （續(xù)）Fig.2(Continued)

利用5個環(huán)境下的數據平均值進行分析，共檢測到9個鈴重相關QTL（表4，圖2）。qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2加性效應值分別為－0.12、－0.14和－0.09，解釋的表型變異率分別為9.27%、11.92%和5.04%。這3個QTL在單環(huán)境聯(lián)合分析中也被檢測到，說明這些位點穩(wěn)定性較好。qBW-A7-1和qBW-A7-2在單環(huán)境聯(lián)合分析中也被檢測到，加性效應值分別為－0.10和－0.13，解釋的表型變異率分別為5.08%和9.62%。在A4和A7兩條染色體上各檢測到3個QTL，推測這兩條染色體與鈴重關系較為密切。

表4 利用5個環(huán)境中鈴重數據平均值檢測到的QTLsTable 4 Detection of QTLs associated with boll weight basing on averages of the five environments

3 討論

3.1 海陸雜交的RILs群體適合QTL定位

由于陸陸雜交群體遺傳背景單一，同質性強，后代遺傳變異范圍較小[28]，因此該研究采用陸地棉中棉所36和海島棉漸滲系G2005構建RILs群體，從而增加了群體的多態(tài)性。每個家系由F2個體經過多年連續(xù)自交得到，家系間基因型各異，群體內鈴重數據近似正態(tài)分布，符合數量性狀遺傳的特點。RILs群體重組程度高于F2群體，其遺傳圖譜比F2群體有著更高的解析度，提高了作圖的精確度。每個家系基因型純合穩(wěn)定，可在多個環(huán)境下進行表型鑒定，這些對獲得穩(wěn)定準確的QTL意義重大。

3.2 SNP標記構建的遺傳圖譜利于QTL定位

陸地棉基因組大，遺傳背景復雜，重復序列多，標記開發(fā)較困難。SNP標記是基因組中數量最多、分布最均勻、多態(tài)性最高的分子標記[29]；相對于SSR標記，它的遺傳穩(wěn)定性更好，易實現分析自動化，是構建遺傳圖譜理想的分子標記[30]。隨著測序成本的不斷降低，SNP標記將在分子標記輔助選擇育種中發(fā)揮更大的作用。本研究總共得到369 223個SNP，親本間具有多態(tài)性的有78 127個，多態(tài)性標記的比例達到21.16%，遠大于常規(guī)SSR標記的多態(tài)性標記比例。利用SNP數據和SSR標記相結合構建的遺傳圖譜，不僅提高了圖譜的密度和覆蓋度，也間接比較了圖譜的準確性[31-32]，因此定位的QTL結果更可信。中棉所36和G2005的測序深度分別為6.43×和10.57×，可能是兩者在遺傳背景上存在部分差異。2個材料的生育期、開花期、吐絮期、果枝始節(jié)等性狀也存在差異[23]，進一步說明兩者基因組成有一定差異。RAD-seq是1種對酶切產生的基因組標簽序列進行高通量測序的技術，測序深度相差較大可能是由于不同材料基因組酶切位點分布及數量不同，但是本研究中的測序深度可以滿足后續(xù)的分析。

3.3 環(huán)境對鈴重的影響

鈴重屬于數量性狀，易受外界環(huán)境和栽培條件的影響，5年間的表現略有差異。2011、2013、和2014年鈴重波動較大，主要原因是：2011年安陽氣候條件總體是前期旱，中后期雨澇。具體表現為7月中旬之前干旱無雨，棉鈴發(fā)育受影響；8～9月份陰雨天較多，對棉鈴的充實和吐絮極為不利。2013年和2014年，安陽的氣候條件總體是前中期雨水多，后期天氣晴好。具體表現為7月中旬到8月初陰雨較多，不利于成鈴；9月份秋高氣爽，氣溫較高，有利于上部棉鈴的充實，雖然單株鈴數較少，但鈴重較高。

3.4 增效基因來源于雙親

中棉所36和G2005均含有與鈴重相關的QTL增效位點，說明增效基因并非總是來源于高值親本[33]，低值親本對鈴重提高也有一定貢獻。增效基因來自低值親本的原因如下：高值親本中含有激活有利基因的調控基因，雜交后代獲得其調控基因后可激活低值親本有利基因的表達；由于隱蔽效應導致增效基因在低值親本中不表達，當發(fā)生重組時才被檢測到；兩者相互作用的結果[34]。

3.5 QTL數據庫比對

將棉花QTL數據庫（http://www.cottonqtldb.org）鈴重相關的QTL轉化成對應染色體的物理圖距[35-36]，并與本研究結果進行比對，結果發(fā)現13個QTL位點（qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A4-3、qBW-A4-4、qBW-A5-1、qBW-A5-2、qBW-A9-1、qBW-A9-2、qBW-A10-2、qBW-A13-1、qBW-D4-1、qBW-D4-2、qBW-D8-2）與前人總結的結果相一致，說明這些位點對鈴重有一定的影響。qBW-A4-1、qBW-A4-2和qBW-A5-2在本研究的多個環(huán)境下被檢測到，且貢獻率較大，最大達15.83%，可能是較為穩(wěn)定的QTL。qBW-D4-1和qBW-D8-2在數據庫中分別對應的QTLBW11.g和qBW-07A-c24-1，貢獻率分別為38.8%和13.54%，為 主 效QTL。所 以qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D4-1和qBW-D8-2這5個QTL可為鈴重相關候選基因的篩選和驗證提供參考。

4 結論

本研究構建的遺傳圖譜豐富了棉花遺傳圖譜 信 息。qBW-A4-1、qBW-A4-2、qBW-A5-2、qBW-D4-1和qBW-D8-2為分析鈴重遺傳機理提了依據。