異煙肼通過ROS/Casp ase-3信號通路誘導L-02細胞凋亡及槲皮素的保護作用

陳廷玉，王東偉，張金波，王 偉，王景濤，盛顏良，盧春鳳*

（佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007）

異煙肼（isoniazid，INH）是臨床上治療結核病的首選藥物[1]，但因其具有嚴重的肝毒性[2-3]，臨床應用受到了極大的限制。到目前為止，INH的肝毒性機制尚未闡明，因此，闡明其肝毒性機制并尋找安全有效的保肝藥物具有重要的意義。槲皮素（quercetin，Que）是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化和清除自由基等多種作用[4-6]，是具有臨床應用前景的抗氧化劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，INH能誘導肝細胞發(fā)生DNA損傷，槲皮素對其具有保護作用[7-8]。因此，本實驗以人正常肝細胞（L-02細胞）為研究對象，從細胞水平研究INH肝細胞毒性機制，重點探討ROS/Caspase-3信號通路在INH誘導L-02細胞凋亡中的作用及槲皮素的保護效應，以期為臨床尋找安全有效的防治INH肝毒性的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

L-02細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；異煙肼、槲皮素、Rho-123和DCFH-DA均為Sigma公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Hoechst33258染色試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品；兔抗Caspase-3多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及試驗分組 L-02細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，鏡下觀察細胞生長情況，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。將L-02細胞隨機分為4組：對照組，給予等體積的無血清培養(yǎng)基；INH組，給予10 mmol/L INH；25μmol/L槲皮素組，給予10 mmol/L INH和25μmol/L槲皮素；50μmol/L槲皮素組，給予10 mmol/L INH和50μmol/L槲皮素。

1.2.2 MTT法檢測L-02細胞存活率 L-02細胞經(jīng)上述處理24 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，放入CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄96孔板內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，使藍紫色結晶完全溶解。使用酶標儀測定570 nm處的吸光度值D（570），計算細胞相對存活率。

1.2.3 細胞上清液中LDH活性檢測 L-02細胞經(jīng)上述處理24 h后，吸取細胞培養(yǎng)液，離心，取上清液100μL，加入50μL蒸餾水和250μL基質(zhì)緩沖液，混勻，37℃水浴15 min后，加入250μL 2，4-二硝基苯肼，混勻，37℃水浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH 2.5 mL，室溫放置3 min后，用酶標儀在440 nm處測其吸光度值D（440）。按下列公式計算細胞LDH活性。

1.2.4 Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡 L-02細胞經(jīng)上述處理24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入固定液500μL，4℃固定10 min，吸棄固定液，用PBS洗2次。然后加入Hoechst 33258染色液500μL，避光染色5 min。棄去染色液，用冷PBS洗2次，加抗熒光淬滅劑，封片。采用激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，在熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計算細胞凋亡率。

1.2.5 細胞線粒體ROS水平的檢測 收集各組細胞，用差速離心法分離線粒體，加入DCFH-DA，使其終濃度為2μg/mL，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20 min。吸去培養(yǎng)液，用冷PBS洗3遍，并棄去殘液，以去除非特異性熒光，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)DCF熒光強度并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進行熒光強度分析，并計算平均熒光強度。

1.2.6 細胞線粒體膜電位的檢測 收集各組細胞，用差速離心法分離線粒體，加入Rhodamine123染色液，使其終濃度為5 mg/L，37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min；冷PBS洗3遍去除非特異性熒光后，用激光共聚焦測定激發(fā)波長488 nm下的熒光強度值，并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進行熒光強度分析，并計算平均熒光強度。

1.2.7 Western blot法檢測細胞中Caspase-3蛋白表達 L-02細胞經(jīng)上述處理24 h后，收集細胞，提取細胞蛋白，用BCA法進行蛋白定量。每孔上樣10 μg總蛋白，在12%SDS-PAGE中進行電泳分離，然后轉到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入用封閉液稀釋的一抗，室溫孵育1 h，然后4℃冰箱過夜。TBST洗膜后，加入用封閉液稀釋的二抗，室溫孵育1 h。再用TBST洗膜，在暗室中用Super ECL進行化學發(fā)光，X線膠片曝光顯影。掃描膠片，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對目標蛋白進行分析，以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。應用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。INH組與對照組比較，采用兩組間t檢驗，給藥組與INH組比較采用ANOVA進行分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 L-02細胞存活率

L-02細胞存活率檢測結果見圖1，L-02細胞經(jīng)INH處理24 h后，細胞的存活率明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；50μmol/L槲皮素組細胞存活率明顯增加，與INH組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 L-02細胞上清液中LDH活性

L-02細胞上清液中LDH活性檢測結果見圖2，INH組細胞上清液中LDH活性顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細胞上清液中LDH活性明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制細胞LDH的漏出，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖1 L-02細胞存活率

圖2 L-02細胞上清液中LDH活性

2.3 L-02細胞凋亡率

L-02細胞凋亡率檢測結果見圖3，L-02細胞經(jīng)INH處理24 h后，細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細胞凋亡率明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制L-02細胞凋亡，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖3 L-02細胞凋亡率

2.4 L-02細胞線粒體ROS水平

結果見圖4，與對照組比較，INH組L-02細胞線粒體ROS水平顯著升高（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素組ROS水平明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制細胞線粒體ROS的生成，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖4 L-02細胞線粒體ROS水平

2.5 L-02細胞線粒體膜電位

L-02細胞線粒體膜電位檢測結果見圖5，與對照組比較，INH組L-02細胞線粒體ΔΨm顯著降低（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素組細胞線粒體ΔΨm明顯升高，與INH組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素對細胞線粒體有保護作用，且50 μmol/L槲皮素組的保護作用更明顯。

圖5 L-02細胞線粒體膜電位

2.6 L-02細胞Caspase-3蛋白表達

Western blot檢測細胞中Caspase-3蛋白表達的結果見圖6，INH組細胞Caspase-3蛋白表達顯著高于對照組（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素組細胞Caspase-3蛋白表達明顯低于INH組（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素能抑制Caspase-3蛋白表達，且50μmol/L槲皮素組抑制作用更顯著。

圖6 L-02細胞Caspase-3蛋白表達

3 討論

迄今為止，INH肝毒性的具體機制尚未闡明。研究表明，線粒體是多種外源化合物細胞毒性的主要靶點，也是細胞ROS產(chǎn)生的主要場所[9-12]。近年來，線粒體在細胞凋亡機制研究中的作用越來越受到關注[13-14]。因此，本實驗以L-02細胞為研究對象，從細胞凋亡的角度探討INH肝細胞毒性的機制，重點探討ROS/Caspase-3信號通路在INH誘導L-02細胞凋亡中的作用，以及槲皮素對INH所致肝細胞凋亡的保護效應及其機制。本實驗發(fā)現(xiàn)，INH處理L-02細胞后，細胞凋亡率明顯增加，而槲皮素能明顯降低細胞凋亡率，表明INH能誘導L-02細胞凋亡，槲皮素對INH誘導的L-02細胞凋亡具有保護效應。

研究表明，在細胞凋亡發(fā)生時，線粒體的結構和功能會發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為線粒體膜通透性增高，線粒體ΔΨm降低[15]。那么INH誘導L-02細胞凋亡是否與ROS介導的線粒體損傷有關？本實驗檢測了細胞存活率[16]、LDH漏出量及線粒體ΔΨm值。正常情況下LDH存在于細胞內(nèi)，只有當細胞膜損傷時，它才能釋放出來，LDH釋放或漏出是反映細胞膜受損的重要指標，LDH漏出量的多少可間接反映細胞受損的程度[17-19]。線粒體ΔΨm是反映線粒體功能的關鍵指標，線粒體ΔΨm降低，提示細胞發(fā)生線粒體損傷。本實驗結果顯示，INH處理后L-02細胞存活率明顯降低，LDH漏出明顯增加；而槲皮素能明顯增加L-02細胞存活率，使細胞LDH漏出減少。同時，還發(fā)現(xiàn)INH作用L-02細胞后，線粒體ΔΨm明顯降低，而槲皮素可使細胞線粒體ΔΨm明顯升高，表明INH可導致細胞線粒體損傷，使膜通透性增加，促進LDH漏出；槲皮素對線粒體損傷有一定的保護作用[20]，使膜通透性降低，進而減少LDH的漏出。線粒體ΔΨm降低是細胞凋亡的主要事件，線粒體ΔΨm下降可導致線粒體膜通透性增加，激活線粒體細胞凋亡途徑，誘導細胞凋亡，最終導致細胞損傷[21-23]。本實驗發(fā)現(xiàn)，L-02細胞經(jīng)INH處理后，細胞中Caspase-3蛋白表達上調(diào)，而槲皮素作用后能明顯下調(diào)Caspase-3蛋白表達，表明INH能造成L-02細胞線粒體損傷，激活Caspase凋亡蛋白酶，啟動細胞線粒體凋亡途徑，誘導L-02細胞凋亡；槲皮素可保護線粒體膜，阻斷線粒體細胞凋亡途徑[24]，抑制L-02細胞凋亡的發(fā)生。那么INH是如何導致細胞線粒體ΔΨm降低，誘導細胞凋亡？研究表明，ROS的增加可損傷細胞線粒體膜，導致細胞線粒體ΔΨm降低，誘導細胞凋亡發(fā)生[25-26]。因此，本實驗進一步檢測了線粒體ROS水平，結果發(fā)現(xiàn)L-02細胞經(jīng)INH處理后，線粒體ROS水平顯著升高，而槲皮素能降低線粒體ROS水平，提示INH能促進線粒體ROS生成，降低細胞線粒體ΔΨm，誘導細胞凋亡；槲皮素可減少線粒體ROS的生成，增高細胞線粒體ΔΨm，抑制ROS/Caspase-3信號通路誘導的細胞凋亡，保護細胞免受損傷。

總之，在本實驗條件下，INH能誘導L-02細胞發(fā)生凋亡，ROS/Caspase-3信號通路參與了其凋亡的過程；而槲皮素對INH誘導的L-02細胞凋亡具有保護作用，其機制可能是通過抑制ROS釋放，改善線粒體功能，抑制ROS/Caspase-3信號通路阻斷線粒體細胞凋亡途徑，從而抑制L-02細胞凋亡，但具體作用機制還有待于進一步研究。