Hep G2細(xì)胞外泌體沖擊樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用

章 菊，葉書(shū)來(lái)，張昌龍，周 倩

（中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230001）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在中國(guó)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高，而目前HCC的治療處于瓶頸階段，對(duì)于早期HCC患者，手術(shù)切除是最有效的治療方法，然而，大多數(shù)HCC患者被診斷時(shí)已為中晚期，治療效果差，生存期短。免疫治療是一種非常有前途的治療策略，在肝癌中的研究也取得了一定的進(jìn)展[1-2]。

最近外泌體（exosomes）的發(fā)現(xiàn)及其多效生物活性引起了研究者們廣泛關(guān)注，目前被廣泛用于疾病診斷和作為藥物輸送車的研究。近年來(lái)，也有大量研究表明腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體有刺激樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）成熟的效應(yīng)[3]。但是也有研究表明，來(lái)自腫瘤的外泌體有抑制骨髓DCs分化的效應(yīng)[4]。兩種研究結(jié)果的不一致性可能是由于外泌體的來(lái)源和所處環(huán)境不同導(dǎo)致所發(fā)揮的作用不同。本研究將來(lái)源于HCC細(xì)胞的外泌體與DCs共孵育，發(fā)現(xiàn)DCs表面分子上調(diào)，DCs誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖并介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)，此外DCs誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞A549有一定的殺傷作用。提示HCC細(xì)胞的外泌體可能是以DCs為基礎(chǔ)的肝癌或其他腫瘤免疫治療潛在的抗原譜。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人肝癌細(xì)胞系HepG2和人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，100 U/mL青-鏈霉素，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。DCs來(lái)源于人外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清和終濃度為50 ng/mL的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）、白介素 4（recombinant human interleukin，rhIL-4）。高糖DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自澳大利亞Clark公司，rhGM-CSF和rhIL-4購(gòu)自PeproTech，淋巴細(xì)胞分離液Ficoll和單個(gè)核細(xì)胞分離液Percoll購(gòu)自美國(guó)GE公司，抗體FITC-anti-CD86、PE-anti-CD80、PE-anti-CD83購(gòu)自美國(guó)BD 公 司 ， 抗 體 CD63、 CD81、 Calnexin、 HSP70、HSP90 和 甲 胎 蛋 白 （α-fetoprotein， AFP）購(gòu) 自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取 收集HepG2細(xì)胞上清于50 mL貝克曼離心管中，3 000 g離心15 min，除去細(xì)胞碎片，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管，1×104g離心30 min，收集上清液并用0.22μm過(guò)濾頭過(guò)濾，將濾液置新的50 mL專用貝克曼超速離心管，1×105g離心1 h，小心棄去上清，收集管底部的沉淀顆粒，用大量PBS重懸這些小顆粒，1×105g重復(fù)離心1 h。BCA法蛋白定量后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 用PBS溶解蛋白制備外泌體懸浮液，將20μL外泌體在室溫下置于銅網(wǎng)格上1～2 min，濾紙輕輕吸去周圍過(guò)多的液體，室溫下用12%磷鎢酸負(fù)染色1～2 min，室溫下用2%戊二醛固定5 min。隨后用PBS洗滌該網(wǎng)格3次，每次3 min，白熾燈下晾干，于透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)外泌體蛋白 將外泌體直接加入蛋白裂解液RIPA，含1 nmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride， PMSF）冰 上 裂 解 10 min，經(jīng)BCA法蛋白定量后，取20μg加入上樣緩沖液，100℃沸水中煮10 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉，分別加入1∶500稀釋的CD63、CD81、HSP70、HSP90和AFP相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜，經(jīng)二抗孵育顯影后曝光。

1.2.4 DCs的誘導(dǎo) 取健康志愿者外周血200 mL經(jīng)Ficoll和Percoll密度梯度離心分離后得到外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS、終濃度為50 ng rhGM-CSF和rhIL-4的1640培養(yǎng)基，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第3天半量換液，第5天全量換液。第6天加入外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 外泌體沖擊DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響 健康志愿者外周血經(jīng)Ficoll分離得到PBMC，經(jīng)磁珠分離得到T淋巴細(xì)胞，將5μmol/L熒光染料羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxynuorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）標(biāo)記的淋巴細(xì)胞與各組DCs以5∶1比例共培養(yǎng)5 d。實(shí)驗(yàn)分3組即空白淋巴細(xì)胞組、未成熟DCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組、外泌體沖擊后DCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖，收集CFSE陽(yáng)性細(xì)胞，左側(cè)區(qū)域?yàn)镃FSE熒光強(qiáng)度逐漸減弱的增殖淋巴細(xì)胞。

1.2.6 Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng) 將HepG2和A549作為靶細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，分別按效∶靶細(xì)胞25∶1混合，共孵育24 h。實(shí)驗(yàn)分為4組即HepG2細(xì)胞組、未成熟DCs與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）共培養(yǎng)后+HepG2細(xì)胞組、外泌體沖擊后DCs與CTL共培后+HepG2細(xì)胞組、外泌體沖擊后DCs與T淋巴細(xì)胞共培后+A549組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞群為凋亡細(xì)胞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下肝癌Hep G2細(xì)胞來(lái)源的外泌體結(jié)構(gòu)

來(lái)源于肝癌細(xì)胞株HepG2的外泌體，經(jīng)透射電鏡捕獲到一組直徑30～120 nm的小杯狀圓形囊泡，散在或成團(tuán)分布，見(jiàn)圖1。

圖1 電鏡下肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)源的外泌體結(jié)構(gòu)（×150 000）

2.2 Western blot檢測(cè)外泌體中蛋白表達(dá)情況

外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、CD81及熱休克蛋白HSP70、HSP90和肝癌抗原AFP均有表達(dá)，細(xì)胞蛋白Calnexin在HepG2中檢測(cè)到表達(dá)，在外泌體中未檢測(cè)到表達(dá)，提示該小囊泡為真正的外泌體（見(jiàn)圖2）。

圖2 HepG2細(xì)胞及其外泌體中相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 外泌體沖擊DC的形態(tài)和表型

外周血來(lái)源的單核細(xì)胞經(jīng)rhIL-4和rhGM-CSF誘導(dǎo)分化成未成熟DCs（圖3A）；外泌體與DCs共培養(yǎng)48 h后可見(jiàn)大部分細(xì)胞體積增大，懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞邊緣有樹(shù)突樣突起，DCs朝向成熟分化（圖3B）。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，DCs表面分子CD80、CD83、CD86的表達(dá)明顯上調(diào)（圖4）。

圖3 未成熟DCs和成熟DCs（×40）

圖4 DCs表面分子表達(dá)

2.4 外泌體沖擊DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

外泌體與DCs共培養(yǎng)組誘導(dǎo)初始T細(xì)胞增殖顯著高于未成熟DCs組以及T淋巴細(xì)胞空白組（P均＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 肝癌細(xì)胞株HepG2外泌體沖擊DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.5 外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL體外腫瘤殺傷效應(yīng)

結(jié)果顯示，與HepG2細(xì)胞和未成熟DCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組比較，外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL對(duì)肝癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用（P＜0.01）。且對(duì)其他腫瘤細(xì)胞如肺癌細(xì)胞A549也有明顯的殺傷效應(yīng)（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 外泌體沖擊DCs誘導(dǎo)CTL體外特異性和非特異性的殺傷腫瘤效應(yīng)

3 討論

由于肝臟獨(dú)特的免疫耐受性，HCC的治療干預(yù)面臨著挑戰(zhàn)?；贒Cs的免疫治療在人類試驗(yàn)中顯示出良好的前景[5]，抗原來(lái)源的選擇對(duì)DCs介導(dǎo)的免疫療法至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞裂解物曾經(jīng)作為抗原，是激活基于DC的免疫治療有吸引力的策略，但在肝癌患者中的反應(yīng)率相對(duì)較低[6]，腫瘤來(lái)源的外泌體攜帶廣譜抗原可以觸發(fā)CTL交叉抗腫瘤效應(yīng)[7]，作為非細(xì)胞的外泌體用于基于DCs的免疫治療引起了廣泛關(guān)注。

以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療處于廣泛臨床研究階段[8]，腫瘤免疫治療的關(guān)鍵是尋找高效的腫瘤抗原制備成DCs疫苗。研究表明DCs被腫瘤抗原肽沖擊，如甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）[8]，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican 3，GPC-3）[9]和黑色素瘤相關(guān)抗原 1（melanoma antigen-1，MAGE-1）[10]，雖然顯示一定的抗腫瘤效應(yīng)，但是療效有限。研究表明單個(gè)抗原肽很難引發(fā)免疫反應(yīng)并有免疫逃逸的風(fēng)險(xiǎn)[11]，此外，該方法僅限于腫瘤相關(guān)抗原明確鑒定的腫瘤。為了克服這些限制，研究者們?cè)噲D使用其他方法，例如使用腫瘤細(xì)胞裂解物來(lái)沖擊DCs，第一次在人類肝癌患者使用肝癌細(xì)胞裂解物作為抗原沖擊DCs，雖然取得一定的療效，但是患者反應(yīng)依然有限[12]。導(dǎo)致低效率的潛在原因尚不清楚。據(jù)報(bào)道腫瘤細(xì)胞衍生的抑制性因子[如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），白介素 10（interleukin，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和生物因子（如半乳糖凝集素-1、吲哚胺2，3-雙加氧酶和脂滴）]可抑制DCs成熟和T細(xì)胞活化[13-14]，這可能有助于解釋接種腫瘤細(xì)胞裂解物制備的DCs疫苗缺少效率的原因。因此，尋找具有較強(qiáng)免疫原性同時(shí)含較少免疫抑制性物質(zhì)的腫瘤抗原是開(kāi)發(fā)基于DCs免疫治療迫切需要的。

外泌體被認(rèn)為是由多泡小體與細(xì)胞質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外的一種膜泡[15-16]，直徑約30～150 nm，含有多種功能蛋白、mRNA和miRNA[17]，外泌體的蛋白質(zhì)組成很大程度上反映了它們親代細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成[18]，顯示出特異性的細(xì)胞類型[7]。與全細(xì)胞裂解物相比，在腫瘤來(lái)源的外泌體中觀察到富含腫瘤抗原如Melan-A[19]、Silv[7]、癌胚抗原[20]和間皮素[21]，實(shí)際上大多數(shù)腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體都含有腫瘤抗原，提示可以開(kāi)發(fā)基于腫瘤外泌體的腫瘤疫苗。先前對(duì)腫瘤來(lái)源外泌體的研究集中于包括誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡和抑制NK細(xì)胞殺傷活性等一系列不利影響[22]，然而，越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腫瘤來(lái)源的外泌體攜帶大量的腫瘤抗原可激活DCs細(xì)胞，提高抗腫瘤免疫[23]。實(shí)際上，腫瘤來(lái)源的外泌體已經(jīng)被作為腫瘤抗原脈沖DCs，導(dǎo)致腫瘤抗原轉(zhuǎn)移到DCs，在小鼠中能夠誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞依賴的抗腫瘤作用[33]?；谶@種矛盾的觀點(diǎn)一方面可能是在腫瘤進(jìn)展的不同階段腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體所含有的內(nèi)容物不同發(fā)揮作用不同，腫瘤細(xì)胞在發(fā)展或消退的過(guò)程都需要經(jīng)歷促腫瘤和抗腫瘤的平衡打破，另一方面外泌體在體內(nèi)和體外所處的環(huán)境不同作用也會(huì)有差異。本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤的外泌體攜帶大量的腫瘤相關(guān)抗原和熱休克蛋白如HSP90、HSP70。Srivastava等[24]已經(jīng)證明，源自人類腫瘤細(xì)胞質(zhì)的HSP70（HSP70及HSC70）和HSP90（gp96）可以激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。腫瘤的HSP是攜帶腫瘤抗原肽的伴侶蛋白，但是否是外泌體刺激DC成熟的關(guān)鍵蛋白還有待于進(jìn)一步探討。

DCs的成熟伴隨著主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）類分子和共刺激分子的上調(diào)，DCs表現(xiàn)出有效的免疫原性表型，其特征在于釋放IL-12[25]，分泌IL-12的DCs能觸發(fā)強(qiáng)效T（Th1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）為主的免疫反應(yīng).[26]。我們的研究結(jié)果與此相一致，用外泌體沖擊的DCs能夠上調(diào)他們的CD分子的表達(dá)，介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。因此來(lái)自HCC細(xì)胞的外泌體可能是調(diào)節(jié)DCs介導(dǎo)抗腫瘤免疫的重要抗原性物質(zhì)。

CTL在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。一些報(bào)道顯示腫瘤來(lái)源的外泌體構(gòu)成了一種有效的腫瘤抗原遞送系統(tǒng)，體外誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL的殺傷效應(yīng)并且在體內(nèi)提供抗腫瘤的交叉保護(hù)[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)外泌體沖擊DCs體外誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖并介導(dǎo)強(qiáng)烈的特異性腫瘤殺傷效應(yīng)，與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)了一定的非特異性殺傷效應(yīng)。因此推測(cè)HCC細(xì)胞的外泌體可以提供廣譜的腫瘤抗原或免疫原性物質(zhì)，可能為基于DCs的肝癌或其他腫瘤免疫治療提供潛在的腫瘤抗原譜。