人眼表細菌菌群分布及影響因素分析

楊美娜 閔寒毅

健康的眼表對于正常視功能的維持至關重要。在結(jié)構(gòu)上，眼表與眼瞼皮膚相延續(xù)，由結(jié)膜，角膜，鞏膜和淚膜組成，通過與其他成分（如免疫細胞、激素、小分子物質(zhì)及微生物群落等）相互作用，形成眼表微環(huán)境。正常的眼表微環(huán)境對于眼表健康是關鍵的。大多數(shù)人的眼表存在著相對穩(wěn)定的微生物群落[1]。眼表微生物群落包括真菌、細菌及病毒等微生物種類，但數(shù)量最多且最重要的是細菌[2]。菌群受自身營養(yǎng)代謝和宿主免疫屏障等因素作用，形成穩(wěn)定的共生狀態(tài)，正常情況下并不致病，即結(jié)膜囊的正常菌群。機體免疫力下降時，部分定植細菌異常增殖，引起眼部感染，稱之為條件致病菌。

1 眼表細菌菌群的取樣、培養(yǎng)、鑒定方法

1.1 取樣

目前大多數(shù)研究采用的方法是以拭子于結(jié)膜囊取樣。該類方法陽性率高，而又以濕棉拭子取樣培養(yǎng)陽性率最高。其他眼表標本取樣方式包括淚液拭子、結(jié)膜印跡試紙、瞼緣拭子、脫落睫毛等[3]。

1.2 培養(yǎng)及鑒定

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和鑒定方法依賴于實驗室培養(yǎng)和細菌的形態(tài)學特征。其結(jié)果受培養(yǎng)相關因素影響，包括采樣方法、培養(yǎng)基類型（包括“血瓊脂”和“巧克力瓊脂”）、大氣條件（需氧，微需氧和厭氧）、溫度、濕度和培養(yǎng)時間[4]。而新型鑒定方法，如16S rRNA 測序，不受理化因素的限制，檢出率更高。其他方法還包括宏觀基因組測序（更常用于分析微生物代謝和功能途徑）、計算機模擬核型分析、PCR、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和焦磷酸測序。

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)鑒定受各種理化因素影響較大，且依賴于細菌的形態(tài)生物學，檢出陽性率較低，而以16S rDNA/16S rRNA 高通量測序為代表的分子生物學鑒定方法，具有高靈敏度和特異性，能夠全面、精確地鑒定眼表細菌菌群的種屬組成。

16S rDNA 存在于細菌染色體基因組，具有保守性、普遍存在性及特征性，被作為微生物檢測和分類鑒定的一種強有力的分子指標。因16S rDNA 檢測為非培養(yǎng)性分析技術(shù)，故結(jié)果不受抗生素使用的干擾，并適用于鑒定死菌和尚無法培養(yǎng)的細菌。但16S rRNA 高通量測序?qū)υO備條件和實驗成本較傳統(tǒng)的表型鑒定高，故成本是目前限制其推廣的關鍵因素。

2 眼表細菌菌群的分布情況

回顧國內(nèi)大樣本研究，國內(nèi)基于傳統(tǒng)培養(yǎng)及分離鑒定方法的報道基本一致：正常結(jié)膜囊菌群主要包括凝同酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和鏈球菌，其中表皮葡萄球菌是最常見的眼表菌株。孫旭光等[5]對1 411 份結(jié)膜囊標本進行培養(yǎng)，陽性率為35.9%。由高至低分別為凝固酶陰性葡萄球菌（表皮葡萄球菌為主，36.2%）、棒狀桿菌（16.8%）、微球菌屬（12.5%）、金黃色葡萄球菌（10.7%）。王娟等[6]對25 728 名受試者進行結(jié)膜囊細菌培養(yǎng),檢出率最高的3 種細菌分別為表皮葡萄球菌（71.47%)、鏈球菌屬細菌（11.78%)和金黃色葡萄球菌（7.43%)。對1992—2004 年國內(nèi)正常人結(jié)膜囊細菌培養(yǎng)進行Meta 分析顯示陽性率最高的依次為表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、微球菌及類白喉桿菌[7]。國外文獻報道和國內(nèi)的研究結(jié)果基本一致，健康眼表最常見的細菌是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌（包括表皮葡萄球菌），其次為丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬、鏈球菌屬和微球菌屬[2]。基于16S rDNA 基因高通量測序得到健康人眼表細菌種屬的結(jié)果與傳統(tǒng)的一致[8-9]。有學者提出眼表核心菌群的概念，認為假單胞菌（20%），丙酸桿菌（20%），根瘤菌（16%），棒狀桿菌（15%），不動桿菌（12%），短波單胞菌（5%），葡萄球菌（4%），水桿菌（2%），鞘氨醇單胞菌（1%）和鏈球菌（1%）等常見的12 個屬眼部微生物群為眼表核心微生物群[2]。

3 眼表細菌菌群的影響因素

3.1 年齡及性別

國內(nèi)外的研究均支持年齡影響結(jié)膜囊?guī)Ь鸂顩r，其中10 歲以下及60 歲以上者結(jié)膜囊細菌陽性率較高[6，10]。老年組陽性率高，可能與免疫功能減退，淚膜穩(wěn)定性差，淚液分泌減少、淚液成分（抗體、補體、乳鐵蛋白、溶菌酶等）缺乏致眼表的防御性功能降低有關[11]。1 歲以上兒童最常見為表皮葡萄球菌[12]，可能與過敏性結(jié)膜炎、倒睫等刺激導致的不良生活習慣（比如喜揉眼）有關。新生兒結(jié)膜囊分泌物培養(yǎng)陽性率差異較大，菌株多樣，可能受新生兒免疫功能低下及分娩方式影響。

盡管已有證據(jù)證明結(jié)膜囊細菌受性別影響[13-14]，但尚無定論。國內(nèi)有報道稱男性結(jié)膜囊細菌陽性率普遍高于女性[6，15]，而國外的文獻報道更傾向于兩者之間沒有明顯差異[10，16]。

3.2 季節(jié)

季節(jié)主要表現(xiàn)為溫度及濕度的改變，而兩者為影響微生物群落演進的重要因素。結(jié)膜囊溫度和濕度相對穩(wěn)定，但受環(huán)境溫度與濕度影響[17]，并可能影響結(jié)膜囊菌群。國外學者從人口水平，分別以“腋臭、腳氣及胃腸脹氣”三個明確與微生物群落有關的癥狀及疾病為關鍵詞，統(tǒng)計網(wǎng)絡上相關關鍵詞的頻率變化，顯示該類其檢索頻次呈季節(jié)性變化，間接說明季節(jié)對人體微生物群落的影響[18]。國內(nèi)學者證明結(jié)膜囊?guī)Ь闆r隨季節(jié)變化[19-20]，春季（70.5%）及夏季（67.7%）結(jié)膜囊細菌培養(yǎng)陽性率較高，而秋季（42.8%）與冬季（40.4%）較低，差別顯著，但各季節(jié)培養(yǎng)的細菌種類均以凝固酶陰性的葡萄球菌為主，多為表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌（占60.19%）[20]。

3.3 生活習慣

生活習慣對眼表菌群的影響的熱點主要集中于角膜接觸鏡的使用。目前的研究更傾向于佩戴角膜接觸鏡導致眼表菌群的改變，并認為其與眼表感染相關。Sankaridurg 等[21]發(fā)現(xiàn)佩戴軟性角膜接觸鏡與病原菌的定植，尤其是革蘭氏陰性菌如粘質(zhì)沙雷氏菌和流感嗜血桿菌顯著相關。與非鏡片佩戴組相比，佩戴組的干燥結(jié)膜拭子檢測結(jié)果差異更大，接近于皮膚細菌群落結(jié)構(gòu)；其甲基桿菌、乳酸桿菌、不動桿菌和假單胞菌豐度更高，而嗜血桿菌、鏈球菌、葡萄球菌和棒狀桿菌豐度更低[22]。連續(xù)一年佩戴軟性角膜接觸鏡者結(jié)膜囊菌群豐度較對照組高[23]，而檢出的菌群類型無明顯差異。

3.4 是否伴發(fā)其他疾病

3.4.1 干眼癥 淚液在眼表分布形成淚膜，起潤滑作用，同時含有抗菌物質(zhì)，如溶菌酶、乳鐵蛋白、免疫球蛋白A（IgA）、載脂蛋白和補體等，具有免疫防御作用。干眼癥患者的淚液因質(zhì)和量的改變，導致局部的防御機制減退，因此影響淚膜穩(wěn)定性的因素可能導致眼表菌群改變。Graham 等[8]比較正常和干眼患者眼表菌群，發(fā)現(xiàn)正常組常規(guī)細菌培養(yǎng)的陽性率為75%，干眼組為97%，凝固酶陰性葡萄球菌（表皮葡萄球菌為主）是最常分離的細菌；而16S rDNA 測序提示干眼組細菌總體水平較正常組高，但主要菌群一致。而在與干眼癥密切相關的MGD 組（meibomian gland dysfunction）發(fā)現(xiàn)結(jié)膜囊細菌的陽性率及種類均較正常組高，且與干眼嚴重程度呈正相關，分離出的主要菌株均為葡萄球菌，棒狀桿菌和微桿菌科[24]。

3.4.2 瞼緣炎 高瑞等[25]對101 例瞼緣炎患者與85 例健康者做細菌培養(yǎng)陽性的菌株鑒定發(fā)現(xiàn)，瞼緣炎組眼表帶菌量高于健康者，但葡萄球菌屬的陽性率低于正常對照組。朱越峰等[26]報道與健康者相比，瞼緣炎組結(jié)膜囊細菌培養(yǎng)陽性率較高，以表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及棒狀桿菌為主。Lee 等[27]對瞼緣炎患者和健康者的眼表樣本進行DNA 測序分析，發(fā)現(xiàn)瞼緣炎組眼表含有更多的鏈霉菌、棒狀桿菌和棲水菌，而葡萄球菌，鏈霉菌，棒狀桿菌，棲水菌和丙酸桿菌均較正常減少。

3.4.3 白內(nèi)障 國內(nèi)外研究表明[28]，白內(nèi)障患者結(jié)膜囊?guī)Ь示哂诮】嫡?，主要菌株為表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。程瑩瑩等[29]對2004 年1 月—2013 年9 月發(fā)表的國內(nèi)白內(nèi)障術(shù)前結(jié)膜囊細菌培養(yǎng)的文獻進行Meta 分析發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障術(shù)前結(jié)膜囊培養(yǎng)陽性率為26.03%，以表皮葡萄球菌（67.30%）、金黃色葡萄球菌（12.53%）和微球菌（6.98%）為主。但白內(nèi)障患者多為老年人，需排除年齡因素的影響。

3.4.4 糖尿病 國外一項較大規(guī)?；仡櫺匝芯匡@示[30]，糖尿病患者結(jié)膜囊檢出率最高者為金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌，且腸球菌和α-溶血鏈球菌的檢出率增加。國內(nèi)文獻報道糖尿病組和對照組結(jié)膜囊細菌主要為革蘭氏陽性菌，其中表皮葡萄球菌和丙酸痤瘡桿菌檢出率最高[31]。有文獻報道糖尿病患者結(jié)膜囊細菌檢出率及種類與對照組無明顯差異，與糖尿病病程以及類型無直接的關系[32-33]。但有學者提出[34]，糖尿病患者中各菌門的檢出率與對照組無明顯差異，但在糖尿病組中變形菌更為豐富，其不動桿菌含量更高。因此糖尿病患者眼表菌群特征尚待進一步研究。

4 結(jié)論

傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法容易受各種理化因素影響，細菌檢測陽性率低、穩(wěn)定性差。新一代測序和生物信息學方法（如16SrRNA測序）鑒定的眼表微生物群陽性率高。國內(nèi)外不同研究者研究結(jié)果進行比較，健康人眼表細菌培養(yǎng)陽性率、細菌種屬、分布存在有差異，但前三位始終是凝固酶陰性的表皮葡萄球菌、棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌。在干眼癥患者和瞼緣炎患者中，結(jié)膜囊細菌的陽性檢出率均較正常高，前者葡萄球菌呈增多趨勢，而后者呈減少趨勢。角膜接觸鏡的佩戴，可能導致眼表微生物菌群的改變，增加眼表感染的機會。眼表微生物組的持續(xù)研究對于我們了解眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，以及其在眼科疾病中的作用十分必要，為我們預防和治療眼病提供了新思路。