益氣固表丸對慢性阻塞性肺病模型大鼠JAK/STAT通路影響研究＊

金 晶，王 晶，姚梓平，李風森＊＊

（1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 烏魯木齊 830054；3.新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點實驗室 烏魯木齊 830000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一種反復發(fā)作的氣道慢性炎癥性疾病。酪氨酸蛋白激酶/信號傳導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT）信號通路已被證實廣泛參與于COPD病理過程中細胞炎癥及免疫應答[1]。近年來中藥復方通過多環(huán)節(jié)、多靶點協(xié)同干預的優(yōu)勢，能夠有效改善COPD患者的臨床癥狀[2]。益氣固表丸（制劑號：ZJ20130098，國家發(fā)明專利號：201410536529.5）由黨參、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風共13味中藥組成[3]，是新疆維吾爾自治區(qū)某三甲醫(yī)院治療COPD等肺系病癥的常用復方制劑，自2004年以丸劑形式投入臨床以來能夠有效改善患者咳嗽痰多，汗出易感等癥狀[4,5]。本研究通過分析益氣固表丸對COPD模型大鼠治療前后JAK/STAT信號通路相關(guān)炎性因子表達的影響，探討其治療COPD有效性的可能機制，為中西醫(yī)結(jié)合治療COPD探尋新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2011-0004，實驗單位使用許可證號SCXK（新）2011-0001]的SPF級鼠齡8周的雄性Wistar大鼠60只。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度（21±2）℃，濕度40%-50%，自由飲水，正常飲食，體質(zhì)量約（200 ± 50）g。

1.2 試驗用藥

益氣固表丸購自新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院中心藥房（新疆制藥廠，批號20121212），脂多糖（LPS，美國Sigma公司，批號：L-2880），雪蓮過濾嘴香煙（新疆卷煙廠，烤煙型，焦油量13 mg煙氣煙堿量1.1 mg煙氣一氧化碳量13 mg），大鼠IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號均為：GR201604-1），Platinum SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：C11733-038），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：15596-026），M-MLV First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：C28025-032），RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗儀器

試驗動物煙熏箱（自制，大小60cm×50cm×40cm），Wistar大鼠全身暴露型無創(chuàng)肺功能檢測儀（型號：PLY3211，美國Buxco Electronics公司），電子高清顯微鏡（型號：U-CMAD3，日本Olympus公司），全自動圖像分析儀（型號：U-CMAD3，日本Olympus公司），Thermal cycler深孔PCR儀（型號：C1000，美國BIO-RAD公司），全波長酶標儀（型號：Multiskan Spectrum，德國Thermo公司）。

1.4 COPD動物模型造模

模型組及益氣固表丸組大鼠（n=40）放置于動物煙熏箱內(nèi)，給予被動熏煙，煙霧濃度450-500 bpm，30 min/次，間隔3 h/次，12 h更換煙盒1次，同時氣管內(nèi)滴注LPS 0.2 mg·kg-1，共計84天。并于大鼠造模第一天和最后一天，檢測大鼠體質(zhì)量，采用Wistar大鼠肺功能儀檢測大鼠肺功能指標：吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流量（PEF）和每分鐘通氣量（MV），與空白組大鼠比較，下降幅度大于30%即為造模成功[6]。

1.5 試驗方案

大鼠按照隨機數(shù)字原則分為3組，分別為：空白組（n=20）、模型組（n=20）、益氣固表丸組（n=20）。按照人與動物間體表面積折算等效劑量公式折算出試驗用大鼠的每日灌藥量（513 mg·kg-1），空白組及模型組大鼠每日予0.9%生理鹽水6.6 mL灌胃，益氣固表丸組給予益氣固表丸水溶液6.6 mL灌胃，每日兩次，所有的大鼠在給藥期間喂食正常飲食，灌胃84天，處死各組大鼠，取外周血及肺組織進行分析。

表1 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3引物序列表

1.6 病理標本的制作

垂直于支氣管的肺矢狀面最大周徑處取材，取厚約5 mm的取各組大鼠左肺組織，剪成面積為1.5 cm2左右的小塊，浸入2 mL 4%多聚甲醛溶液中固定，使用PBS緩沖液洗滌，并浸泡于固定劑中至少24 h以上。甲醛固定后，石蠟包埋，將標本切為3-4μm并加工用于HE染色。

1.7 外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的ELISA檢測

取各組大鼠外周血2 mL，離心3 000 rpm，10 mins，取血清保存于EP管置于-80℃冰箱保存，檢測時根據(jù)試劑盒說明書操作，于設置450 nm波長的酶標儀上機檢測并計算IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平。

1.8 肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的RT-PCR檢測

依據(jù)Trizol試劑說明書提取各組大鼠右肺組織總RNA，PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反應總體系為25μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，拍照并讀取灰度值，分析JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化情況（表1）。

1.9 統(tǒng)計學處理

圖1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×200）

所得實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行分析，以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩間比較采用LSD-t檢驗。Pearson法相關(guān)性檢驗進行相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織形態(tài)學觀察

對照組：支氣管結(jié)構(gòu)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰。支氣管未見明顯收縮，未見炎癥細胞浸潤，氣道上皮排列整齊，管腔規(guī)則。模型組：支氣管及肺泡組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分結(jié)構(gòu)消失。支氣管粘膜可見大量炎癥細胞浸潤，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。益氣固表丸組：較模型組的炎癥細胞浸潤減輕；支氣管收縮好轉(zhuǎn)；管腔變窄改善，管腔直徑變寬（圖1）。

正常組（A），模型組（B）和益氣固表丸組（C）提示肺結(jié)構(gòu)的組織學改變。模型組大鼠肺組織（箭頭所示）主支氣管結(jié)構(gòu)紊亂和消失，存在廣泛浸潤的炎性細胞，支氣管顯示狹窄和痙攣狀態(tài)，以及不規(guī)則和破裂的氣道上皮（B）；益氣固表丸組大鼠肺組織（箭頭所示）顯示使用益氣固表丸等量水溶液干預后炎癥細胞浸潤減輕；支氣管痙攣狀態(tài)好轉(zhuǎn)（C）。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定結(jié)果

與空白組比較，模型組IFN-γ水平降低（P＜0.05），IL-17a、IL-23及RORγt水平升高，有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），益氣固表丸組IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平升高，有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），與模型組比較，益氣固表丸組IL-17a、IL-23、RORγt水平下降（P＜0.05），IFN-γ水平升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 實時-聚合酶鏈反應（RT-PCR）定量檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組及益氣固表丸組JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA水平均升高，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與模型組比較，益氣固表丸組JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA均降低，有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）（表3，圖2）。

通過RT-PCR分析JAK/STAT通路中基因表達（A）為JAK1擴增曲線，（B）為JAK3擴增曲線，（C）為STAT1擴增曲線，（D）為JAK1擴增曲線，（E）為JAK1溶解曲線，（F）為JAK3溶解曲線，（G）為STAT1溶解曲線，（H）為STAT3溶解曲線

2.4 JAK1、JAK3、STAT1、STAT3 與 IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相關(guān)性分析

JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-17a顯著相關(guān)（P＜ 0.01），JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-23相關(guān)（P＜ 0.05），JAK1與IFN-γ呈負相關(guān)（P＜ 0.05），JAK3、STAT1與STAT3與IFN-γ無相關(guān)（P＞0.05），JAK1、JAK3、STAT1及 STAT3與 RORγt無相關(guān)（P＞ 0.05）（表4）。

3 討論

氣道炎癥反應的持續(xù)狀態(tài)是COPD過程中重要的病理狀態(tài)[7]。JAK/STAT通路的激活與炎癥因子的表達密切相關(guān)，多種細胞因子如干擾素受體家族（IFN-γ）以及白介素受體家族（白細胞介素IL-17a、IL-23）等，通過激活JAK/STAT通路，在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的重要作用[8,9]。中醫(yī)藥通過調(diào)控STAT通路防治COPD的研究，逐漸顯示出較大的潛力和廣闊的應用前景，許光蘭等[10]證實清金化痰顆粒能夠抑制IL-6的水平的升高，下調(diào)JAK/STAT信號通路中STAT1，STAT3的過度表達和持續(xù)活化，從而減輕氣道炎癥，抑制COPD急性發(fā)作與加重。Wang C[11]發(fā)現(xiàn)六味補氣膠囊可有效抑制JAK/STAT通路活性，明顯提高了肺氣虛型COPD穩(wěn)定期患者的生活質(zhì)量和肺功能。

熊斌等[12]認為“脾虛”對免疫功能的影響與JAK/STAT通路異常表達有關(guān)。因此，考慮能否通過中醫(yī)的健脾的治法以改善免疫功能的異常，是現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合證治研究的關(guān)注點，益氣固表丸是建立在“培土生金”治則上針對臨床肺脾氣虛證COPD相關(guān)病癥患者的復方制劑，方中黨參具有補中益氣，健脾益肺之功效，為方中之君藥，能夠健運脾氣之大統(tǒng)，輔以白術(shù)、茯苓，淡滲利濕以醒脾，薏苡仁利濕健脾，半夏、陳皮以行“二陳湯”之理氣和中兼燥濕之功效，脾氣得充則有化濕之力，浮小麥滋陰斂汗而清肺之虛熱，以防子（肺）火乘母（脾）臟，防風入肝脾經(jīng)，以祛風勝濕固表，余藥以清利肺氣，諸藥共參，多種藥物綜合起效達到共奏“抑炎抗氧化”之效。本次研究通過益氣固表丸的干預，研究JAK/STAT通路的活性，是本次研究的目的，試驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠外周血及肺組織中，炎性因子如：白細胞介素（IL-17a、IL-23）、RORγt水平升高，IFN-γ水平下降，STAT1、STAT3 mRNA表達顯著高于正常組，IL-17a及IL-23是T淋巴細胞亞群的下游產(chǎn)物，考慮IL-17a及IL-23的升高與Th17Treg亞群失衡有關(guān)，提示COPD的病情進展與JKA/STAT通路的持續(xù)活化與其下游炎癥蛋白過度表達密切相關(guān)，益氣固表丸干預后可使上調(diào)的IL-17a、IL-23及RORγt水平下降，升高下調(diào)的 IFN-γ水平，同時升高 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3 mRNA的表達，起到抑制JAK/STAT通路活性的作用，下一步的研究將通過研究T淋巴細胞亞群失衡情況，以了解JAK/STAT通路與Th17Treg比例的關(guān)系，以及相關(guān)中藥對通路及淋巴細胞亞群的影響。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK3、STAT1、STAT3的mRNA表達與IL-17a、IL-23成正相關(guān)，JAK1、JAK3與IFN-γ呈負相關(guān)，進一步證明IL-17a和IL-23具有強大的致炎性，是聯(lián)系T細胞與中性粒細胞的重要介質(zhì)，能夠激活JAK/STAT通路，進一步肯定了炎性細胞因子在COPD病變過程中的作用。

表2 各組大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比較/ng·mL-1（ˉ± s）

表2 各組大鼠外周血IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt水平的比較/ng·mL-1（ˉ± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組相比，P＜0.05。

RORγt 8.49±0.45 36.41±2.34*20.09±1.84*△520.013＜0.001分組空白組模型組益氣固表丸組F P IL-17a 14.36±0.94 89.91±0.94*53.08±2.95*△1627.6＜0.001 IL-23 30.90±3.96 74.21±4.91*54.93±5.09*△172.165＜0.001 INF-γ 65.06±1.81 49.63±3.12*55.32±1.58*△94.405＜0.001

表3 各組大鼠肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比較/ng·mL-1（±s）

表3 各組大鼠肺組織JAK1、JAK3、STAT1及STAT3的比較/ng·mL-1（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.01。

STAT3 1.0±0.0 4.21±1.82*2.08±0.97*△11.267 0.001空白組模型組益氣固表丸組F P JAK1 1.0±0.0 5.05±2.50*0.89±0.43*△15.76＜0.001 JAK3 1.0±0.0 4.08±0.97*3.13±0.71*△30.386＜0.001 STAT1 1.0±0.0 5.93±2.30*1.72±0.89*△20.932＜0.001

表4 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3與IL-17a、IL-23、IFN-γ及RORγt的相關(guān)性分析/ng·mL-1

圖2 JAK1、JAK3、STAT1及STAT3RT-PCR圖形

4 結(jié)論

COPD模型大鼠肺組織中JAK/STAT通路處于激活狀態(tài)，益氣固表丸通過下調(diào)外周血中IL-23及IL-17a水平，升高IFN-γ水平，抑制肺組織中JAK/STAT通路中相關(guān)因子mRNA水平的表達，改善COPD模型大鼠氣道炎癥水平及病理學變化。