信鴿糞便樣品中四種常見病原的檢測與分析

王樂 蔣智宇 朱建國 張孟濤 余磊 孫淑紅* （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100 山東農(nóng)業(yè)大學 山東 泰安）

?

信鴿糞便樣品中四種常見病原的檢測與分析

王樂①?蔣智宇②?朱建國②張孟濤②余磊②孫淑紅②*（①齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100 ②山東農(nóng)業(yè)大學 山東 泰安）

為評估某大型信鴿飼養(yǎng)場信鴿的健康風險，本研究對新城疫病毒(NDV)、H9流感病毒(AIV-H9)、沙門氏菌和大腸桿菌等四種信鴿常發(fā)病原進行了檢測，并對其常用敏感藥物的使用現(xiàn)狀評估。從樣本總量為15000只左右的某信鴿群隨機采集56份新鮮糞樣，對沙門氏菌、大腸桿菌進行分離鑒定，取4份用K-B法檢測常用藥物耐藥情況；隨機取24份糞便樣品分別提取RNA，用針對NDVHN和F基因2對引物、AIV-H9的1對引物分別進行RT-PCR檢測NDV和AIV攜帶情況。結(jié)果表明，NDV和AIV-H9的RT-PCR檢測結(jié)果顯示均為陰性(0/24、0/24)；沙門氏菌檢測為陰性(0/56)，大腸桿菌檢測陽性率為71.42%(40/56)；4份大腸桿菌陽性的糞樣藥敏試驗結(jié)果顯示為頭孢西丁、頭孢他啶敏感，本研究對該信鴿群的養(yǎng)殖健康以及合理用藥等方面有一定的指導意義。

信鴿大腸桿菌 沙門氏菌新城疫病毒(NDV) H9流感病毒(AIV-H9)

信鴿也稱“通信鴿”，經(jīng)由普通鴿子馴化，然后提取其優(yōu)越性能并加以利用和培育而產(chǎn)生。人們利用信鴿天生的歸巢本能，可用來傳遞緊要信息；現(xiàn)在信鴿的主要用途是比賽，即稱為“賽鴿”，由于賽鴿具有一定的可觀賞性以及在比賽過程中可以獲得經(jīng)濟效益，近些年出現(xiàn)了許多賽鴿養(yǎng)殖場，用于培育、飼養(yǎng)、訓練賽鴿，以求得在比賽過程中獲得優(yōu)異成績，并選育出可用于繁殖后代的優(yōu)質(zhì)種鴿。顯然，健康優(yōu)秀的信鴿是比賽獲得名次的必要條件，本研究擬通過對信鴿糞便樣品中的四種常見病原的檢測[1]以及對常用藥物敏感試驗的測定，初步評估該信鴿群健康風險[2]，并為養(yǎng)殖信鴿過程中的抗生素使用提供參考。該研究對信鴿養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 某規(guī)?；砒潏觯骛B(yǎng)15000羽信鴿，用無RNA酶的離心管采集56份新鮮糞便樣品。

1.1.2 試驗材料 質(zhì)控大腸桿菌(菌株編號為ATCC25922)，腸炎沙門菌(菌株編號CVCC3377)由山東農(nóng)業(yè)大學家禽疫病防控研究室保存；沙門菌顯色培養(yǎng)基(上海欣中生物工程有限公司)；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；RNA isolater(Vazyme Bio)；50×TAE buffer：242gTris，57.1ml冰醋酸、100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加雙蒸水定容至1000ml，工作濃度為1×TAE；TAE緩沖液：取20ml50×TAE，加水定容至1000ml；DL2000DNA Maker(寶生物(大連)有限公司)；LB培養(yǎng)基：細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g(Bacto-teyptone)(OXOID公司)、細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g(Bacto-yeast extract)(OXOID公司)、NaCl 10g，瓊脂粉(Solarbio)15g，1000ml去離水；緩沖蛋白胨水(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 用滅菌棉簽挑取信鴿新鮮糞便樣品(每5只信鴿的糞樣作為一個樣本)，放入無RNA酶的2ml離心管中，用含有冰袋的泡沫盒6h內(nèi)運回實驗室。

1.2.2 樣品的處理和保存 每份糞便樣品分為兩部分，其一加入適量RNase-free水稀釋，用于RNA提??；其二用于沙門菌和大腸桿菌的分離鑒定。56份(編號1~56)糞便樣品分別用于沙門菌和大腸桿菌分離鑒定以及藥敏試驗；隨機取24份(編號1~24)加入少許RNase-free水，震蕩混勻后先-20℃環(huán)境放置30min，然后轉(zhuǎn)移到-80℃保存，提取RNA，然后用于NDV、AIV的RT-PCR檢測。

1.2.3 樣品中沙門氏菌、大腸桿菌的分離鑒定 本方法以GB 4789.4-2016國標為基礎，經(jīng)本實驗室改進后對沙門氏菌、大腸桿菌進行分離鑒定，并用PCR方法重復檢測2次，保證在檢測過程的準確性和靈敏性。其中，顯色培養(yǎng)基使用說明可知，大腸桿菌在平板上表現(xiàn)為藍色，沙門氏菌變現(xiàn)為紫色?？梢删涞腜CR驗證：根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌、大腸桿菌保守區(qū)域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物FimW、E-jiand。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成(見表1)；PCR陽性的菌落再次劃板純化培養(yǎng)20~24h，然后再次挑取可疑菌落進行PCR重復驗證。

瓊脂凝膠糖電泳：吸取5μl保存的PCR產(chǎn)物，注入1%瓊脂糖凝膠，以120V電壓進行電泳檢測，并加入DNA分子量標志(DNA maker)以輔助判讀DNA樣品。50min電泳結(jié)束后，如大腸桿菌E-jiand引物所合成的目的基因在622bp左右，則視為大腸桿菌陽性；如沙門氏菌FimW引物所合成的目的基因在495bp左右，則視為沙門氏菌陽性。

表1 沙門菌FimW和大腸桿菌E-jiand鑒定引物信息

①將紫色可疑菌落用沙門氏菌FimW引物進行PCR驗證，將藍色可疑菌落用大腸桿菌E-jiand-F/R引物進行PCR驗證；②FimW引物檢測沙門菌的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落為模板(忽略不計)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃ 4min(預變性)，94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共25個循環(huán)， 72℃ 10min(延伸)，4℃結(jié)束；③E-jiand-F/R引物檢測大腸桿菌的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、以可疑菌落為模板(忽略不計)、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃預變性7min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃結(jié)束。

1.2.4 大腸桿菌陽性陽性的藥物敏感試驗 使用K-B法檢測9種常用抗菌藥物的敏感性?？咕幬锇ǎ褐Z氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、頭孢西丁、頭孢他啶、慶大霉素、多粘菌素B等。

1.2.5 檢測糞便 樣品中NDV、AIV-H9的RT-PCR檢測糞便樣品總RNA提取及總RNA濃度的測定及質(zhì)量檢測：采用試劑盒分別提取樣品總RNA，用Nanodrop ND-1000測定RNA樣品質(zhì)量和濃度，記錄OD260/OD280，OD260 /OD230的值，兩個值均在1.8~2.0范圍內(nèi)，表明提取的RNA純度較高。反轉(zhuǎn)錄：本研究參照Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進行，用20μl體系，最終將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并-20℃保存。具體操作方法見表2。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系 (μl)

RT-PCR檢測糞便樣品中NDV、AIV-H9：引物設計根據(jù)GenBank公布的NDV保守區(qū)域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物NDV(HN-S、HN-F)與AIV-H9保守區(qū)域的基因序列，用Primer5.0軟件設計引物AIV-H9，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成(見下表3)。

表3 NDV(HN-S、HN-F)、AIV-H9引物相關(guān)信息

③HN-S/ HN-F引物檢測NDV的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 10.5μl；程序94℃ 5min(預變性)，94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 2min，共30個循環(huán)，72℃ 10min(延伸)，4℃結(jié)束；④AIV-H9引物檢測流感病毒的程序和體系：體系共25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl、cDNA模板1μl、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl、ddH2O 11.5μl；程序94℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃結(jié)束。

瓊脂凝膠糖電泳：同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1 信鴿糞樣中四種常見病原檢測結(jié)果

從56份糞便樣品中檢測到40份大腸桿菌陽性率為71.43%(40/56)，見表4、圖1；沙門氏菌檢測為陰性(0/56)，見表4、圖2。檢測的24份cDNA中NDV檢測為陰性，陽性對照成立(1776bp左右的特異性條帶，圖3)；檢測的24份cDNA中AIV-H9檢測為陰性，陽性對照成立(850bp左右的特異性條帶，圖4)。

表4 四種常見病原的檢測結(jié)果

圖1 部分大腸桿菌的PCR結(jié)果瓊脂凝膠電泳圖

圖2 部分沙門氏菌的PCR結(jié)果瓊脂凝膠電泳圖

圖3 部分樣品NDV(NH-S)的PCR結(jié)果瓊脂凝膠電泳圖

圖4 部分樣品AIV-H9PCR結(jié)果瓊脂凝膠電泳圖

2.2 藥敏試驗檢測結(jié)果

隨機取4份大腸桿菌陽性樣品(編號38、42、24、53)，做常用藥物的藥敏試驗。結(jié)果表明：4份樣品均對頭孢西丁、頭孢他啶敏感，對諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、慶大霉素表現(xiàn)為耐藥，對多粘菌素B表現(xiàn)為部分耐藥(見表5)。

表5 4份細菌陽性樣品的藥敏直徑 （mm）

3 討論

（1）鴿新城疫與沙門氏菌的混合感染[3]、鴿NDV與AIV-H9的混合感染[4]、致病性大腸桿菌和沙門氏菌引起鴿腸炎的報道[5]近年來屢次報道。顯然，常見病原的污染以及不合理濫用抗生素，已經(jīng)成為影響信鴿健康養(yǎng)殖的潛在風險。隨著信鴿飼養(yǎng)業(yè)不斷興起，人們對信鴿的健康養(yǎng)殖越來越關(guān)注。（2）本研究結(jié)果顯示，24份抽檢糞便樣品中NDV與AIV-H9均為陰性，而我們在前期普查中發(fā)現(xiàn)該鴿群新城疫抗體均勻度較好(平均6~8log2)，該檢測結(jié)果在一定程度上反映出該信鴿場對常見病毒病的防控效果較好。56份糞便樣品未檢出沙門菌，大腸桿菌陽性檢出率為71.43(40/56)，但檢測出來的大腸桿菌是否對信鴿具有致病性仍需要后續(xù)實驗加以探究。藥敏試驗顯示為頭孢西丁、頭孢他啶對糞便中細菌敏感，對諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、慶大霉素表現(xiàn)為耐藥，對多粘菌素B表現(xiàn)為部分耐藥。結(jié)果表明，該鴿群細菌耐藥情況嚴重，應采取合理用藥、尋找抗生素的有效替代品等措施來減少耐藥細菌的產(chǎn)生。（3）本研究以該大型信鴿飼養(yǎng)場的新鮮糞便樣品為實驗材料，完成了信鴿四種常見病原的檢測及其耐藥情況測定，該研究對該信鴿群的健康養(yǎng)殖的初步評估及其合理選擇使用抗生素，減少耐藥菌群的出現(xiàn)等方面有一定的指導意義。本批次信鴿糞便樣品中未檢測出NDV、AIV-H9以及沙門氏菌，但更完整全面了解該信鴿群常見病原污染情況，仍需要周期性地采樣檢測病原，并結(jié)合血清抗體結(jié)果以及臨床癥狀等進一步評估。

[1] 李治, 范俊清等. 信鴿新城疫病毒的分離、鑒定及F基因的進化分析[J]. 中國家禽, 2018, 40(8): 56-59.

[2] 李建國, 覃杰等. 信鴿新城疫的防治[J]. 畜禽業(yè), 2018, 29(8): 138-140.

[3] 楊平, 劉永恒, 張軍等. 一例信鴿新城疫與沙門氏菌混合感染的診斷與治療[J]. 家禽科學, 2015(9): 36-37.

[4] 徐技松, 張軍, 劉永恒. 1例信鴿新城疫的診斷與治療[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治, 2016(9): 37-38.

[5] 趙蘭斌. 鴿子的沙門氏菌病的診斷治療[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘, 2018, 34(5) :210-219.

（2018–08–10）

?共同第一作者；

S852.61

A

1007-1733(2019)01-0001-03