產甲殼素酶菌株的篩選與誘變

摘要：以膠體甲殼素作為惟一碳源，從自然界微生物中篩選并誘導到一株產甲殼素酶活性較高的菌株，經16S rDNA鑒定為Aeromonas sp.。并以該菌株作為出發(fā)菌株，經過一次紫外誘變，酶活是初篩菌株的1.48倍。再經過二次紫外誘變或者紫外-LiCl復合誘變，酶活分別是初篩菌株的3.16和3.87倍，最高酶活達到3.48 U/mL。最后通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，確定了菌株HMX-16經過紫外和復合誘變后突變性狀穩(wěn)定性良好。

關鍵詞：甲殼素酶；紫外誘變；紫外-LiCl復合誘變；產酶活性

中圖分類號：Q93-331；Q933 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1062-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.009

Abstract： A chitinase-producing strain was isolated and induced from various wild type microorganisms with colloidal chitin as the sole carbon source， and identified as Aeromonas sp. by 16S rDNA. After first ultraviolet （UV） mutagensis， the highest chitinase production of the mutated strain was increased by 1.48 times. After the second UV mutagenesis or UV-LiCl mutagenesis，the highest chitinase activity were increased by 3.16 and 3.86 times. The highest activity was increased to 3.48U/mL. The strain HMX-16 obtained with the best activity had good genetic stability after UV and UV-LiCl mutagenesis.

Key words： chitinase； UV mutagenesis； UV-LiCl mutagenesis； chitinase production

甲殼素作為一種結構多糖在自然界分布廣泛，廣泛存在于甲殼動物的外殼、節(jié)肢動物的骨骼以及真菌和藻類的細胞壁中，是地球上除纖維素外的二大生物資源，也是保健食品、醫(yī)用材料和化妝品工業(yè)的重要原料[1，2]。由于甲殼素分子很大，分子之間存在強烈的分子間和分子內氫鍵作用，很難溶于酸、堿和一般的有機溶劑，從而大大限制了甲殼素的應用。和大分子甲殼素相比，甲殼低聚糖無毒、易被人體吸收，并具有抗腫瘤、增強免疫力、抗菌、降膽固醇、保濕及促進植物抗逆生長等多種生理功能，在食品、醫(yī)藥、農業(yè)等領域有著廣泛的應用前景，成為近年來的研究熱點[3]。酶法生產甲殼低聚糖具有條件溫和、水解反應易于控制、不造成環(huán)境污染等優(yōu)點，特別是專一性酶親和力強，選擇性高，產品質量好，所以，采用酶法降解甲殼素一直是目前國內外研究的熱點[4]。但目前專一性甲殼素酶價格昂貴，活性較低，難以商品化，因此尋求高活性的產甲殼素酶菌株仍是目前甲殼低聚糖研究和應用開發(fā)的關鍵[5]。

甲殼素酶（Chitinase，EC.3.2.1.14）是一類能催化降解甲殼素β-1，4？螄糖苷鍵的水解酶，可以根據其酶切位置不同，分為內切甲殼素酶和外切甲殼素酶，外切甲殼素酶可分為甲殼二糖酶和N-乙酰氨基葡萄糖酶。甲殼素酶廣泛存在于動物、植物以及微生物（細菌、放線菌、真菌）中[6]，據統(tǒng)計，迄今已發(fā)現約50個屬近100種甲殼素酶產生菌[7-9]，在植物病蟲害防治和甲殼素生物資源利用等領域有廣泛的應用前景。目前，雖然已經從多種微生物中分離出甲殼素酶，但大多數產酶能力都較低。而誘變育種是篩選菌株最常用的方式之一[10，11]。紫外線輻照是一種較為常用的物理誘變方式，操作方便、安全，沒有化學誘變劑毒性，對原核生物而言是一種比較好的誘變因素。氯化鋰是一種堿金屬鹵化物，單獨使用是一種弱誘變劑，但可協同作用來提高誘變效果。

本研究采用透明圈法從自然界微生物中篩選到一株產甲殼素酶活性較高的菌株，采用物理誘變、復合誘變處理，最后通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，篩選出一株產甲殼素酶活性較高并穩(wěn)定性良好的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與儀器 菌株來源于湖北省所取得的土樣，所用試劑均為分析級。超凈工作臺（SW-CJ-1D型，蘇州凈化設備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（HP300GS-C型智能人工氣候箱，武漢瑞華儀器有限責任公司）、離心機（TG16-11型高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司）、分光光度計（WFJ2000型分光光度計，上海智城分析儀器制造有限責任公司）。

1.1.2 10 g/L膠體甲殼素制備 稱取商用甲殼素20 g，溶于130 mL 50%的硫酸中，用玻璃棒攪拌均勻，放置于4 ℃冰箱溶解2 d。完全溶解后，過濾除去雜質。加入3倍以上體積的無水乙醇。4 ℃醇沉過夜，用去離子水洗滌，8 000 r/min離心20 min，去掉多余的水分，再洗滌直至pH 6.5，最后用去離子水定容到2 L[12]。

1.1.3 培養(yǎng)基 10 g/L膠體甲殼素和含其他培養(yǎng)基成分的水溶液分開滅菌，使用前等體積混合。

1）富集培養(yǎng)基：最終濃度為甲殼素5 g/L，K2HPO4 0.7 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， 酵母粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L， NaCl 5 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L ， 去離子水 1 000 mL， pH 7.0。

2）初篩平板培養(yǎng)基：最終濃度為甲殼素5 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L， K2HPO4 0.7 g/L，KH2PO4 0.3 g/L， NaCl 5 g/L， MgSO4·7H20 0.5 g/L， 瓊脂20 g/L，，去離子水1 000 mL， pH 6.5。

3）斜面（種子）培養(yǎng)基：最終濃度為甲殼素5 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L， K2HPO4 0.7 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， NaCl 5 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母粉 5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，去離子水1 000 mL， pH 6.5。

4）發(fā)酵復篩培養(yǎng)基：最終濃度為甲殼素5 g/L，（NH4）2SO4 10 g/L， K2HPO4 0.7 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，去離子水1 000 mL， pH 6.5。

5）含氯化鋰培養(yǎng)基：最終濃度為甲殼素5 g/L，LiCl 3 g/L， （NH4）2SO4 10 g/L， K2HPO4 0.7 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂20 g/L，去離子水1 000 mL， pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 產甲殼素酶菌種的篩選及鑒定 采集湖北省水產加工廠周圍的土壤樣品，稱取10 g土樣，加入到90 mL無菌生理鹽水中，30 ℃搖床中160 r/min振蕩1 h。將渾濁的樣品靜置至澄清，吸取澄清的上清液5 mL加到100 mL富集培養(yǎng)基中富集2 d。然后將富集培養(yǎng)基進行適當的稀釋，涂布于以膠體甲殼素為惟一碳源的初篩平板，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。采用透明圈法挑選透明圈直徑（C）和菌落直徑（H）比值（C/H）較大的菌株進行搖瓶發(fā)酵復篩，篩選出一株產甲殼素酶活性比較高的菌株，斜面（種子）培養(yǎng)基保藏，并進行16S rDNA鑒定。

1.2.2 誘變方法

1）一次紫外誘變。從斜面上培養(yǎng)好的出發(fā)菌株挑取1～2環(huán)到種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)到對數生長期6 000 r/min離心10 min后，沉淀用無菌鹽水懸浮并洗滌，3次重復后，將菌懸液加入到裝有玻璃珠的250 mL的搖瓶中，30 ℃搖晃1 h。將菌懸液稀釋至濃度為107～108個/mL，將7 mL菌懸液均勻涂布于各無菌平皿中，在30 W紫外燈下，距離28 cm處分別照射0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s。4 ℃放置2 h后進行適當稀釋，涂布于初篩平板上，每個稀釋梯度3個平行，30 ℃避光培養(yǎng)2 d。將誘變前后的稀釋液平板計數，計算致死率。根據所得的致死曲線結果得到合適的照射時間。重復前面的操作，將菌懸液在紫外燈下照射合適的時間，進行適當倍數稀釋，涂布于甲殼素酶初篩平板，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 d。挑取透明圈直徑與菌落直徑比值相對較大的菌株接種于斜面培養(yǎng)基，然后對所選菌株進行發(fā)酵試驗和酶活測定。

2）二次紫外誘變。選取一次紫外誘變酶活最高的菌株作為出發(fā)菌株，重復一次紫外誘變操作。

3）紫外-氯化鋰復合誘變。選取一次紫外誘變酶活最高的菌株作為出發(fā)菌株，以二次紫外照射中最有可能得到發(fā)生正突變的時間對菌株進行照射，之后進行適當梯度的稀釋涂布于含氯化鋰培養(yǎng)基的平板，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值相對較大的菌株進行酶活測定。

1.2.3 酶活測定方法

1）Schales試劑制備：稱取53 g碳酸鈉，溶解于800 mL 超純水中，加入0.5 g鐵氰化鉀，溶解后用去離子水定容至1 000 mL。

2）采用鐵氰化鉀法測定：取培養(yǎng)后的發(fā)酵液，以8 000 r/min離心10 min，1.0 mL發(fā)酵上清液和1 mL 10 g/L膠體甲殼素（膠體甲殼素懸浮于50 mmol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液）37 ℃反應1 h[12]，做3份平行。然后8 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液和4 mL的Schales 試劑沸水浴反應15 min。迅速冷卻，在波長420 nm處測定吸光度。酶活定義為在37 ℃反應下，每小時釋放1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需要的酶量為1 U。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選結果

采集50多個土壤和污水樣品，采用以膠體甲殼素為惟一碳源的初篩平板進行初篩，平板透明圈如圖1所示，命名為X0。將所得菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)復篩，以膠體甲殼素為底物通過測定甲殼素酶活，得到一株產甲殼素酶活性較高（0.9 U/mL）的菌株，證明甲殼素酶的存在。對該菌株進行16S rDNA鑒定，初步鑒定為氣單胞菌屬的一種（Aeromonas sp.）。

2.2 一次紫外誘變結果

出發(fā)菌株X0經紫外線照射不同時間后，致死率如圖2所示。由圖2可知，紫外照射時間越長，對于菌體細胞的傷害越大，菌體的死亡率在15 s之前迅速增加，菌體細胞的存活率相應地迅速降低。從圖2 可以看出當照射時間在10 s時，菌體的死亡率達到70.45%；照射時間20 s時，致死率為95.75%。根據研究報道，致死率在70%～80%時，誘變效果最好[13]。由此選擇10 s作為最佳誘變時間，得到60株誘變菌株，其中有15株酶活相對較高，甲殼素酶活如表1所示。從表1可以看出，UV1-7的酶活最高，為1.33 U/mL，酶活是初篩菌株的1.48倍。

2.3 二次紫外誘變結果

選取一次紫外誘變的菌株UV1-7作為二次紫外誘變的出發(fā)菌株，對UV1-7菌株進行不同時間的照射，結果如圖3所示。從圖3可以看出，照射15 s時，致死率達到了78.3%；在25 s致死率達到了92.4%。出發(fā)菌株UV1-7經過紫外照射不同時間后，隨著照射時間的延長，菌體的存活率明顯下降。根據報道，選擇致死率在70%～80%之間的照射時間作為最優(yōu)照射時間[13]。所以選擇照射時間15 s進行二次紫外誘變，根據C/H的不同，挑選了60株接種到斜面上，然后測定這60株菌的酶活，其中有15株菌比UV1-7產的甲殼素酶活性高。這15株菌株酶活結果如表2所示，其中菌株UV2-7產的甲殼素酶活性最高（2.84 U/mL），是初篩菌株的3.16倍。比較UV1-7和UV2-7的致死曲線，表現出不同，說明經過一次紫外誘變后，菌株的抗紫外能力略有提高。

2.4 二次紫外-LiCl復合誘變結果

以一次紫外誘變酶活最高的菌株UV1-7為出發(fā)菌株，紫外時間選擇二次紫外誘變的15 s。菌株經過紫外照射后，將菌液涂布于LiCl平板上。恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃ 培養(yǎng)3 d后，挑取C/H較大的30株菌，接入斜面培養(yǎng)基，之后進行酶活測定，其中有9株菌株產的甲殼素酶活性較高，結果如表3所示。由表3可知，UVL-7所產酶的活性最高（3.48 U/mL）。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗結果

選擇經過以上誘變方法得到的菌株中產甲殼素酶活最高的菌株UVL-7，進行遺傳穩(wěn)定性試驗，結果如表4所示。由表4可知，通過對UVL-7進行產酶特性的研究，傳代六次，相對于UVL-7產酶的活性，最高為1.239倍，最低為1.176倍?？芍摼暝诹鷥冗z傳穩(wěn)定較好，因此選擇UVL-7作為最后誘變所選菌株，命名為HMY-16。

3 小結

本試驗從不同來源的土壤和廢水中得到一株產甲殼素酶的菌株，對該菌株進行了一次紫外誘變，二次紫外誘變或者紫外和LiCl復合誘變。酶活分別達到了1.33、2.84和3.48 U/mL，酶活分別為初篩菌株（0.9 U/mL）的1.48，3.16和3.87倍。挑選酶活最高的菌株UVL-7進行遺傳穩(wěn)定性試驗，傳代六次，表明其在六代內酶活相對穩(wěn)定，命名其為HMX-16。

參考文獻：

[1] 伊金玲.產甲殼素酶菌株HD002的篩選鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶的分離純化及酶學性質研究[D].山東青島：中國海洋大學，2010.

[2] GOODAY G W. Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan[J]. Biodegradation， 1990，1（2-3）：177-190.

[3] LIANG T W， CHEN Y Y， PAN P S， et al. Purification and chitinase/chitosanase from Bacillus cereus and discovery of an enzyme inhibitor[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2014， 63：8-14.

[4] 萬云洋，杜予民，楊建紅，等.甲殼酶特性與應用研究[J].天然產物研究與開發(fā)，2003，15（6）：572-579.

[5] 韓寶芹，伊金玲，蔡文娣，等.產甲殼素酶菌株的發(fā)酵條件、酶的分離純化及酶學性質研究[J].中國海洋大學學報（自然科學版），2010，40（10）：57-62.

[6] SCHLUMBAUM A， MAUCH F， V？魻GELI U， et al. Plant chitinases are potential inhibitors of fungal growth[J]. Nature， 1986，324： 365-367.

[7] WANG S L， SHIH I L， LIANG T W， et al. Purification and characrization of two antifungal chitinases extracellularly produced by Bacillus amyloliquefaciens V656 in a shrimp and crab powder medium[J]. Agricultural and Food Chemistry， 2002， 50（8）：2241-2248.

[8] MUKHERJEE G， SEN S K. Purification， characterization， and antifungal activity of chitinase from Streptomyces venezuelae P10[J]. Current Microbiology， 2006， 53（1）：265-269.

[9] ESCOTT G M， HEARN V M， ADAMS D J. Inducible chitinolytic system of Aspergillus fumigatus[J]. Microbiology， 1998，144：1575-1581.

[10] 李真金，任 丹，蘇文濤，等.L-乳酸高產菌選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].四川大學學報（自然科學版），2011，48（2）：451-456.

[11] 邱雁臨，梁 亮， 汪 亮.紫外線與氯化鋰復合誘變選育L-組氨酸產生菌[J].現代食品科技，2008，24（3）：217-219.

[12] SAIMA M K， ROOHI I Z. Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，2013， 11（1）：39-46.

[13] 張 克，旭陳寧，張 蓓，等.代謝控制發(fā)酵[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1998.