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    新中國(guó)成立70年來(lái)我國(guó)植物代謝領(lǐng)域的重要進(jìn)展

    2019-01-29 09:03:24孫俊聰侯柄竹陳曉亞唐克軒黎勝紅尚軼崔光紅段禮新黃三文漆小泉
    關(guān)鍵詞:倍半萜三萜青蒿素

    孫俊聰 侯柄竹 陳曉亞 唐克軒 黎勝紅 尚軼 崔光紅 段禮新 黃三文 漆小泉

    代謝是生命活動(dòng)的基本特征。光能通過(guò)植物的光合作用固定到簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物分子中,再經(jīng)過(guò)植物基礎(chǔ)代謝以及多種多樣的特異代謝途徑,合成結(jié)構(gòu)各異的復(fù)雜代謝物。這些代謝物不僅在維持植物的基本生長(zhǎng)發(fā)育及世代繁衍中具有至關(guān)重要的功能,還在抵御各種生物和非生物逆境、適應(yīng)多種極端環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。作物生產(chǎn)的主要代謝物作為糧、棉、油在人類生存中起到不可替代的作用,多種植物源活性化合物是人體的必需營(yíng)養(yǎng)成分和藥物成分。

    新中國(guó)成立初期到20世紀(jì)末,我國(guó)科學(xué)家在植物基礎(chǔ)代謝、植物活性天然產(chǎn)物的挖掘、植物代謝工程等方面做出了突出貢獻(xiàn),特別是在青蒿素的研發(fā)方面取得了突破性的進(jìn)展,為我國(guó)植物代謝研究奠定了良好的基礎(chǔ)。自2000年以來(lái),我國(guó)植物代謝研究進(jìn)入一個(gè)較快速的發(fā)展階段,取得了一批具有影響力的成績(jī)。比如基本完成了整個(gè)棉酚合成途徑的解析,發(fā)現(xiàn)了二倍半萜合成途徑,系統(tǒng)鑒定了水稻的多條三萜代謝途徑及其功能,闡明了調(diào)控合成黃瓜苦味素基因簇的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,應(yīng)用遺傳代謝組學(xué)手段揭示了水稻及番茄代謝網(wǎng)絡(luò),解析了青蒿素、丹參酮和丹酚酸等多種藥用活性成分的代謝調(diào)控途徑和網(wǎng)絡(luò)。

    1 基礎(chǔ)代謝途徑

    呼吸作用是有機(jī)體生命現(xiàn)象最基本的過(guò)程,呼吸代謝是植物體內(nèi)的基礎(chǔ)代謝。20世紀(jì)30年代以來(lái),Tang在羽扇豆中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素氧化酶,并報(bào)告該酶不能被CO完全抑制,首次做出了植物呼吸末端氧化絕不是由一條途徑進(jìn)行的推斷;同期,提出了測(cè)定活體細(xì)胞色素氧化酶與氧親和力(Km值)的湯氏公式,湯氏公式與米氏公式(Michaclis equation)性質(zhì)是相同的,但湯氏公式僅適用于活體細(xì)胞或組織。新中國(guó)成立后,湯佩松繼續(xù)對(duì)水稻幼苗的呼吸代謝及其調(diào)控進(jìn)行系統(tǒng)研究,揭示了在高等植物(水稻幼苗)中存在多條呼吸代謝途徑,于1956年提出了代謝的控制與被控制的“多條路線”觀點(diǎn),即高等植物的呼吸作用并不是一些單純的生物化學(xué)過(guò)程的組合,而是與植物其他生理功能相互依存、相互制約的一個(gè)生命基本活動(dòng)過(guò)程。隨后的系列研究,應(yīng)用測(cè)壓法、酶學(xué)方法和同位素示蹤等方法在整體水平和亞細(xì)胞水平上證明了同一種植物中有糖酵解途徑(embden meyerhofparnas pathway,EMP)、戊糖磷酸途徑(hexose monophosphate pathway,HMP)、三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA)、二羧酸循環(huán)(dicarboxylic acid cycle,DCA)和乙醛酸循環(huán)(glyoxylic acid cycle,GAC)途徑的存在,且TCA,DCA和GCA同時(shí)運(yùn)行,其比例大約為10︰2︰1,說(shuō)明水稻幼苗的丙酮酸氧化以TCA為主,同時(shí)還有其他途徑。類似的結(jié)果被梁厚果和呂忠恕及施教耐在白蘭瓜和油菜籽實(shí)中分別得到了證實(shí)。此外,1956年湯佩松與吳相鈺合作,發(fā)現(xiàn)水稻幼苗硝酸還原酶的適應(yīng)形成,是首次報(bào)道在植物中存在適應(yīng)酶,證實(shí)了代謝途徑受外界環(huán)境條件影響而改變這一觀點(diǎn);1964年,薛應(yīng)龍研究楊樹葉柄脫落機(jī)制時(shí)證明了呼吸途徑對(duì)生理功能(器官脫落)的調(diào)控;1965年,施教耐對(duì)油菜籽實(shí)形成過(guò)程的研究證實(shí)了內(nèi)部因素能夠引起呼吸途徑的改變;1978年,湯佩松再次以水稻幼苗為代表,證實(shí)了線粒體中的電子傳遞途徑也是多條的。綜合以上研究結(jié)果,湯佩松于1979年提出了完整的高等植物“呼吸代謝多條路線”理論,具體包括:(?。┖粑x(包括底物水平和末端氧化水平)的途徑是多條和多方向的;(ⅱ)植物的代謝為基因所控制,基因的表達(dá)通過(guò)代謝而實(shí)現(xiàn);(ⅲ)基因控制的多條途徑的時(shí)空有序表達(dá)即為植物的發(fā)育過(guò)程;(ⅳ)代謝對(duì)基因表達(dá)有調(diào)控作用?!岸鄺l路線”的“整體”思想是以高等植物基礎(chǔ)代謝的研究為基礎(chǔ)提出的,對(duì)指導(dǎo)代謝生理和生命科學(xué)的研究具有極其重大的意義,同時(shí)也為指導(dǎo)特異代謝物合成的代謝工程(當(dāng)今的合成生物學(xué))的研究和生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

    2 植物活性天然產(chǎn)物的挖掘

    植物能產(chǎn)生豐富的天然產(chǎn)物。在我國(guó)幾千年的中醫(yī)藥實(shí)踐中,已鑒定出了大量的藥用植物。一般這些植物的藥用部位都有含量較豐、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、活性較高的天然產(chǎn)物。我國(guó)植物化學(xué)起步于100多年前,新中國(guó)成立以來(lái),隨著現(xiàn)代儀器分析新技術(shù)、分離新方法和新材料的快速發(fā)展,植物化學(xué)研究也取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。20世紀(jì)50—60年代,莊長(zhǎng)恭等人從漢防己分離得到防己諾林堿;趙承嘏從木防己中分離得到木防己甲素和乙素;朱子清首次提出了貝母生物堿的基本骨架;朱任宏和羅尚義從紫草烏中分離出鎮(zhèn)痛劑紫草烏堿甲;曾廣方從黃柏中提取出了小檗堿,通過(guò)氫化得到鎮(zhèn)痛劑四氫巴馬汀堿;趙承嘏從常山中分離出抗瘧疾藥物常山堿;黃鳴龍等人確定了山道年11-CH3的絕對(duì)構(gòu)型,改進(jìn)了甾族藥物的工業(yè)合成,以薯蕷皂苷元為原料通過(guò)7步反應(yīng)合成可的松,完成了16-甲基地塞米松和16-米松的工業(yè)合成路線,合成了女用口服避孕藥甲地孕酮。周俊等人從中藥天麻中發(fā)現(xiàn)活性成分——天麻素,研制成為治療血管性頭痛、神經(jīng)性頭痛和神經(jīng)綜合征的新藥。

    20世紀(jì)70年代,為了防治瘧疾的肆意危害,我國(guó)發(fā)揮舉國(guó)體制下的優(yōu)勢(shì),成立了“523”項(xiàng)目組,開展抗瘧疾藥物篩選攻關(guān)。項(xiàng)目組匯集了全國(guó)60多個(gè)單位的500余名科研人員。項(xiàng)目組成員屠呦呦等人在整理匯編我國(guó)大量中醫(yī)抗瘧方藥集的基礎(chǔ)上,從晉代葛洪《肘后備急方》記載的“青蒿一握,以水二升漬,絞取汁,盡服之”中獲得啟發(fā),采用低沸點(diǎn)溶劑提取方法,成功分離純化出具有100%抗瘧活性的倍半萜內(nèi)酯類化合物青蒿素單品(C15H22O5),并解析其結(jié)晶結(jié)構(gòu),相關(guān)結(jié)果于1977年3月以“青蒿素結(jié)構(gòu)研究協(xié)作組”名義發(fā)表在《科學(xué)通報(bào)》。由于青蒿素在瘧疾治療上具有極高的治愈率和較低的副作用,挽救了全球特別是發(fā)展中國(guó)家的數(shù)百萬(wàn)人的生命,主要發(fā)現(xiàn)人屠呦呦研究員獲得2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

    20世紀(jì)80年代,李伯剛等人研制出防治心血管疾病的甾體皂苷類天然藥物——地奧心血康。陳昌祥和周俊發(fā)現(xiàn),重樓屬植物的止血活性成分偏諾皂苷,研究制成治療婦科出血新藥——宮血寧。孫漢董等人從70年代起開始系統(tǒng)研究香茶菜屬植物的二萜類活性成分,發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素、毛萼乙素等1200余個(gè)化合物,其中有開發(fā)應(yīng)用前景的化合物20余個(gè),并從20世紀(jì)90年代開始研究五味子科植物化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)高度氧化、骨架重排、環(huán)系極其復(fù)雜的“五味子降三萜”新化合物340余個(gè),引起國(guó)際同行的廣泛關(guān)注。梁曉天等人完成了50余種中草藥化學(xué)成分研究,發(fā)現(xiàn)200余種新成分,首次發(fā)現(xiàn)過(guò)氧鍵為抗瘧有效基團(tuán)。姚新生研究組從人參、線麻葉、薤白、蓽解等數(shù)十種中草藥中分離了百余種活性化合物,并研制治療大動(dòng)物腸梗阻的線麻葉注射液、治療心血管疾病的羊霍片、治療肝炎的板蘭根注射液等。岳建明研究組對(duì)150多種重要藥用植物進(jìn)行了深入系統(tǒng)的化學(xué)和生物活性研究,發(fā)現(xiàn)了 800多個(gè)新天然化合物,包括大量新骨架類型和重要研究?jī)r(jià)值的生物活性分子。

    通過(guò)我國(guó)植物化學(xué)和中醫(yī)藥科技工作者的共同努力,分離和鑒定了大量藥用植物的藥活性成分、新骨架天然產(chǎn)物。具有代表性的臨床藥物除青蒿素之外,還有石杉?jí)A甲、黃連素、延胡素乙素、樟柳堿、天麻素、三尖杉、脂堿、丹參素、冬凌草素、五味子素等。

    3 植物代謝工程研究

    利用植物代謝工程(細(xì)胞工程)等方法,使植物能高效地生產(chǎn)人們所需要的重要代謝產(chǎn)物或藥用蛋白等。在植物(番茄、生菜)中成功表達(dá)了具有生物活性的鮭魚降鈣素、凝血因子Ⅸ等臨床重要藥用蛋白。上海交通大學(xué)唐克軒研究組利用植物代謝工程技術(shù),使得莨菪發(fā)根中東莨菪堿含量提高了9倍;青蒿中青蒿素含量提高了2~3倍;成功培育多個(gè)高產(chǎn)抗腫瘤藥物長(zhǎng)春堿前體長(zhǎng)春質(zhì)堿、文多靈等長(zhǎng)春花代謝工程品種,含量提高了1.5~2倍,是目前全球少有的掌握了長(zhǎng)春花組織再生和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室;結(jié)合植物代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù),在青蒿底盤中高效合成了重要香料成分廣藿香醇等產(chǎn)物。

    4 棉酚合成途徑解析

    棉花合成并積累棉酚等倍半萜醛類化合物,作為植保素幫助植物抵御病菌侵染和動(dòng)物取食。但棉酚可對(duì)人畜健康造成危害,從而限制了棉籽中油脂和蛋白質(zhì)的利用。陳曉亞研究組對(duì)棉酚生物合成途徑開展了系統(tǒng)深入的研究,早期工作先后克隆鑒定了法尼基二磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,F(xiàn)PS)、杜松烯合酶(cadinene synthase,CDN)和杜松烯羥化酶CYP706B1,它們催化棉酚途徑上游3步連續(xù)的反應(yīng)。杜松烯合酶是棉酚途徑的關(guān)鍵酶,也是較早克隆的植物倍半萜合酶之一;杜松烯羥化酶則是CYP706家族中第一個(gè)被確定功能的酶,兩個(gè)酶都已用于棉籽無(wú)酚材料的研制與培育。

    近年來(lái),基因組學(xué)的快速發(fā)展和基因數(shù)據(jù)的大量涌現(xiàn),使得代謝途徑研究的方法與策略發(fā)生了根本性變革。陳曉亞研究組利用相關(guān)突變體,通過(guò)多重轉(zhuǎn)錄組和基因共表達(dá)分析,分離鑒定了細(xì)胞色素 P450單加氧酶 CYP82D113和CYP71BE79、醇脫氫酶DH1以及2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶2-ODD-1,明確了棉酚途徑除芳香化以外的大部分反應(yīng)步驟,為全面解析代謝途徑鋪平了道路。

    對(duì)倍半萜合成的調(diào)控機(jī)制研究也取得了進(jìn)展。陳曉亞研究組發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子 GaWRKY1控制杜松烯合酶基因的表達(dá),從而參與棉酚途徑調(diào)控。該工作被評(píng)價(jià)為萜類合酶基因轉(zhuǎn)錄因子的首次報(bào)道。棉酚等植保素儲(chǔ)藏在有色腺體中,該研究組與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)合作,克隆了控制腺體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子PGF。此外,還研究了防御激素和年齡因子對(duì)倍半萜生物合成的調(diào)控。通過(guò)病毒介導(dǎo)的基因沉默,鑒定了棉酚途徑的一系列中間產(chǎn)物,其中8-羥基-7-羰基-杜松烯屬于活性親電化合物(reactive electrophilic species,RES),積累后嚴(yán)重?cái)_亂并削弱植物的抗病性。CYP71BE79高效轉(zhuǎn)化該中間產(chǎn)物,在酶水平上避免自毒性的產(chǎn)生。棉酚生物合成途徑的解析是作物和植物次生代謝研究的重要進(jìn)展,對(duì)棉花品質(zhì)改良、棉籽副產(chǎn)品綜合利用具有重要意義,對(duì)我國(guó)植物次生代謝研究起到了推動(dòng)作用。

    在植物的環(huán)境適應(yīng)尤其是抗病抗蟲反應(yīng)中,次生代謝發(fā)揮重要作用。陳曉亞研究組分離了參與半棉酚聚合的分泌型漆酶,通過(guò)基因工程使植物的根分泌漆酶,可轉(zhuǎn)化土壤中酚類污染物,為植物體外環(huán)境修復(fù)提供了新策略;發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲P450單加氧酶CY-P6AE14可被棉酚誘導(dǎo),提出了次生代謝物誘導(dǎo)昆蟲抗藥性發(fā)展的新觀點(diǎn);在國(guó)際上率先研發(fā)并報(bào)道了植物介導(dǎo)的 RNAi(RNA interference)抗蟲技術(shù),即在植物中表達(dá)昆蟲特異基因的雙鏈RNA,專一地抑制昆蟲基因表達(dá),干擾昆蟲對(duì)棉酚等代謝物的耐受性進(jìn)而抑制其生長(zhǎng),為開發(fā)新一代安全有效的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái),該技術(shù)的應(yīng)用取得長(zhǎng)足進(jìn)展,2017年美國(guó)環(huán)保署批準(zhǔn)了第1個(gè)以RNAi為基礎(chǔ)的抗根蟲玉米,我國(guó)也研制了RNAi抗蟲棉花、水稻及抗黃萎病棉花。

    5 二倍半萜代謝途徑及功能研究

    植物二倍半萜結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜、活性廣泛,是萜類天然產(chǎn)物中的一個(gè)重要亞類,目前全世界共報(bào)道了1200余個(gè),絕大部分在海洋生物中發(fā)現(xiàn),植物中僅發(fā)現(xiàn)了140余個(gè)。黎勝紅研究組從唇形科大型木本和有色花蜜藥用植物米團(tuán)花(Leucosceptrumcanum)的腺毛發(fā)現(xiàn)了一類新穎骨架(命名為米團(tuán)花烷)的二倍半萜Leucosceptroids A和B,對(duì)植食性昆蟲和植物病原菌均具有顯著的防御功能,研究結(jié)果拓展了對(duì)植物腺毛化學(xué)防御的認(rèn)識(shí)。采用激光顯微切割-超高壓液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(laser microdissection-ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry,LMDUPLC/MS/MS)的新技術(shù)方法,從另一唇形科藥用植物火把花(Colquhounia coccineavar.mollis)的盾狀腺毛中發(fā)現(xiàn)了另一類新穎骨架(命名為火把花烷)和防御功能的二倍半萜Colquhounoids A-C。進(jìn)一步深入研究從上述兩種植物中發(fā)現(xiàn)了150余個(gè)結(jié)構(gòu)新穎且高度變化的二倍半萜或降二倍半萜化合物,包括呋喃型、五元環(huán)酮型、內(nèi)酯型、內(nèi)酰胺型、螺環(huán)類以及降二倍半萜等,并發(fā)現(xiàn)這些化合物普遍具有較強(qiáng)的昆蟲拒食和抗炎免疫活性。

    在植物二倍半萜生物合成方面,黎勝紅研究組從米團(tuán)花腺毛中克隆并功能鑒定了一個(gè)二倍半萜生物合成途徑的關(guān)鍵酶香葉基法尼基焦磷酸酯合成酶(geranylfarnesyl diphosphate synthase,GFDPS),發(fā)現(xiàn)植物二倍半萜的生源途徑是定位于質(zhì)體中的 MEP(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate)途徑,并提出植物 GFDPS可能起源于正選擇(環(huán)境脅迫)下香葉基香葉基焦磷酸酯合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGDPS,二萜直鏈前體合成酶)的復(fù)制和新功能化。王國(guó)棟研究組和張鵬研究組合作對(duì)擬南芥 GGDPS基因的功能進(jìn)行了全面生化分析,從中鑒定了4個(gè)GFDPS,并解析了其中一個(gè)GFDPS的晶體結(jié)構(gòu),從蛋白結(jié)構(gòu)的角度解析了植物GFDPS新功能出現(xiàn)的氨基酸位點(diǎn)和酶學(xué)反應(yīng)機(jī)制,并基于該機(jī)制從其他十字花科植物中鑒定了一系列 GFDPS。王國(guó)棟研究組與王勇研究組合作對(duì)擬南芥中與GFDPS成簇存在的萜類合酶的功能進(jìn)行了研究,鑒定了兩個(gè)二倍半萜合酶TPS18和TPS19,能催化GFDP分別生成兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的二倍半萜(+)-thalianatriene和(?)-retigeranin B,并利用同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn),推測(cè)了其可能的生物合成途徑。此外,王國(guó)棟研究組與白洋研究組合作發(fā)現(xiàn),擬南芥二倍半萜生物合成基因簇是通過(guò)最近的復(fù)制和新功能化形成的,并發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)氨基酸位點(diǎn)對(duì)二倍半萜合酶功能的形成至關(guān)重要。另外,該研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)二倍半萜合酶(TPS25和TPS30)的產(chǎn)物特異性地在根部積累,并參與調(diào)控?cái)M南芥根系微生物的組裝。

    6 三萜代謝途徑以及調(diào)控機(jī)制研究

    植物三萜化合物數(shù)目眾多、結(jié)構(gòu)多樣。目前已發(fā)現(xiàn)的三萜化合物超過(guò)20000種,發(fā)現(xiàn)的三萜碳骨架結(jié)構(gòu)近200個(gè),其中許多具有抗蟲、抗菌的作用,也是中藥的主要有效活性成分,有極高的應(yīng)用價(jià)值。氧化鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)是三萜化合物生物合成的關(guān)鍵酶,可催化2,3-環(huán)氧鯊烯通過(guò)形成不同構(gòu)象,合成多種多樣的三萜骨架。中國(guó)科學(xué)院植物研究所漆小泉研究組對(duì)水稻三萜環(huán)化酶進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)掘和生化功能解析,鑒定出秈稻醇合酶(OsOSC7i)和禾谷絨氈醇合酶(OsOSC12)等多個(gè)功能新穎的三萜環(huán)化酶以及秈稻醇(orysatinol)、禾谷絨氈醇(poaceatapetol)等多個(gè)新型三萜環(huán)化產(chǎn)物。秈稻醇的發(fā)現(xiàn)打破了普遍認(rèn)為的三萜類化合物合成途徑的反應(yīng)規(guī)則,提供了形成三萜骨架的新途徑,研究揭示了植物如何利用相同的底物產(chǎn)生構(gòu)象和結(jié)構(gòu)各異的三萜類化合物的催化機(jī)制。這些成果為今后利用生物學(xué)手段生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的三萜類活性化合物奠定了基礎(chǔ)。更重要的是,他們發(fā)現(xiàn),保守的三萜合酶 OsOSC12/OsPTS1缺失會(huì)阻礙水稻花粉包被三種主要脂肪酸合成,進(jìn)而導(dǎo)致花粉??焖偈鴣喡樗岷蛙浿峄蛴仓岬幕旌衔飫t可以阻止突變花粉粒的過(guò)度失水,揭示了濕敏雄性不育(humidity-sensitive genic male sterility,HGMS)的分子機(jī)制,未來(lái)可能用于水稻、小麥、玉米以及其他禾本科作物雜交育種。

    除了三萜環(huán)化酶,P450氧化酶、乙酰基/糖基轉(zhuǎn)移酶也是重要的三萜合酶。這些合成基因往往以基因簇的形式分布在植物基因組中。漆小泉研究組與合作者首次在燕麥中發(fā)現(xiàn)了三萜合成基因以基因簇的形式參與抗菌物燕麥素生物合成。另一類四環(huán)三萜類化合物葫蘆素是黃瓜、甜瓜、西瓜等葫蘆科植物苦味物質(zhì)。這類化合物為大多數(shù)食植物性昆蟲所不喜,而且醫(yī)學(xué)研究顯示它們還具有抗腫瘤活性。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文研究組與合作者通過(guò)整合黃瓜基因組、變異組以及轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)大數(shù)據(jù)與分子生物學(xué)、生物化學(xué)等傳統(tǒng)生物學(xué)研究手段發(fā)現(xiàn)了葫蘆素 C生物合成基因簇,包括1個(gè)2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶、7個(gè)P450氧化酶和1個(gè)乙?;D(zhuǎn)移酶。這些合成基因在苦的黃瓜葉片和果實(shí)中大量表達(dá)。進(jìn)一步,通過(guò)構(gòu)建酵母工程菌,成功闡明了環(huán)化酶、2個(gè)P450氧化酶和乙?;D(zhuǎn)移酶的催化功能。進(jìn)一步利用多年篩選到的無(wú)苦味黃瓜葉片和果實(shí)突變體,他們還發(fā)現(xiàn)了2個(gè)調(diào)控葫蘆素 C合成的“主開關(guān)”基因Bl(Bitterleaf)和Bt(Bitterfruit),屬于在葉片和果實(shí)中特異表達(dá)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子,可結(jié)合到9個(gè)葫蘆素 C合成基因的啟動(dòng)子并激活它們的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而控制黃瓜葉片與果實(shí)苦味物質(zhì)合成。上述研究首次揭示了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控代謝基因簇中各個(gè)基因表達(dá)的分子機(jī)制?;蚪M標(biāo)記示蹤研究顯示,Bt基因在馴化過(guò)程中受到了人工選擇,使得極苦的野生黃瓜衍生出不帶有苦味的栽培品種。進(jìn)一步通過(guò)比較黃瓜、西瓜和甜瓜的基因組和多重組學(xué)代謝研究策略,發(fā)現(xiàn)了西瓜苦味物質(zhì)葫蘆素E和甜瓜苦味物質(zhì)葫蘆素 B的合成基因簇及其調(diào)控、果實(shí)苦味性狀馴化的分子機(jī)制,也揭示了2個(gè)P450氧化酶丟失和功能改變是導(dǎo)致葫蘆素B/C/E結(jié)構(gòu)差異形成的主要原因。

    7 多組學(xué)揭示代謝網(wǎng)絡(luò)及功能

    植物能夠產(chǎn)生大量不同的化合物,這對(duì)植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)起著至關(guān)重要的作用,同時(shí)這些代謝物也為人類生存提供了必不可少的營(yíng)養(yǎng)、能量和藥物來(lái)源。水稻作為全球最重要的糧食作物,研究其代謝組的變異及其遺傳基礎(chǔ)具有重要的價(jià)值。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅杰研究組利用廣靶向的代謝檢測(cè)技術(shù)對(duì)水稻葉片的840種代謝物進(jìn)行了鑒定,為研究水稻代謝物的變異提供了重要的數(shù)據(jù),研究從代謝組的水平揭示了秈、粳稻的差異。通過(guò)整合529份水稻的基因組數(shù)據(jù),利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)代謝物的遺傳位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)36個(gè)候選基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。相關(guān)研究為水稻代謝物的深入解析奠定了基礎(chǔ)。漆小泉研究組采用混合所有生物樣本的質(zhì)控樣本(quality control,QC)作為代謝物混合池(pool),對(duì)QC進(jìn)行逐級(jí)稀釋,結(jié)合溶劑空白,提出五步峰過(guò)濾規(guī)則,區(qū)分假陽(yáng)性質(zhì)譜信號(hào)和評(píng)價(jià)每一個(gè)峰的定量能力(quantitative performance)。同時(shí)引入相對(duì)濃度指數(shù)(relative concentration index,RCI),結(jié)合QC梯度稀釋曲線,建立所有質(zhì)譜峰的定量校正模型。該方法可以消除標(biāo)準(zhǔn)品組成的人工樣本中92.4%的假陽(yáng)性,可以消除水稻籽粒提取樣本中71.4%的假陽(yáng)性質(zhì)譜峰信號(hào)。

    風(fēng)味品質(zhì)一直是番茄品質(zhì)和育種研究的一個(gè)難點(diǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃三文研究組與佛羅里達(dá)大學(xué)Harry Klee團(tuán)隊(duì)合作將代謝組數(shù)據(jù)和感官品嘗相結(jié)合,測(cè)定了100多種番茄的品嘗實(shí)驗(yàn)和果實(shí)中78種主要物質(zhì)含量,并利用數(shù)據(jù)模型最終確定了番茄中30多種主要的風(fēng)味物質(zhì)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),13種風(fēng)味物質(zhì)在現(xiàn)代番茄品種中含量的急劇降低是導(dǎo)致現(xiàn)代品種風(fēng)味品質(zhì)缺失的重要原因。通過(guò)對(duì)450份番茄種質(zhì)的全基因組測(cè)序和風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定,利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析最終鑒定了影響27種物質(zhì)的250多個(gè)主效的遺傳位點(diǎn)。此研究首次確定番茄風(fēng)味形成的物質(zhì)和遺傳基礎(chǔ),為風(fēng)味育種提供路線圖。

    在此基礎(chǔ)上,黃三文研究組與羅杰研究組進(jìn)一步整合399份番茄材料基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組數(shù)據(jù),利用多重組學(xué)方法全面地揭示了番茄代謝物的育種歷史。首次發(fā)現(xiàn)了番茄從野生到栽培馴化過(guò)程中番茄堿人工馴化的遺傳基礎(chǔ),并發(fā)現(xiàn)了大量調(diào)控番茄風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)性狀的遺傳位點(diǎn)。上述發(fā)現(xiàn)為解析重要品質(zhì)性狀遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為番茄的全基因組設(shè)計(jì)育種提供了重要支撐。

    8 藥用植物活性成分的生物合成

    全球抗瘧市場(chǎng)對(duì)青蒿素的需求巨大,但青蒿中青蒿素的含量?jī)H為其葉片干重的0.1%~1%,因此提高青蒿中青蒿素含量也成為全球研究的熱點(diǎn)。唐克軒教授研究組完成了青蒿全基因組測(cè)序工作,鑒定了多個(gè)調(diào)控青蒿素生物合成及腺毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子,提出青蒿素代謝工程領(lǐng)域的 6大研究策略。(?。┐蚱撇呗裕哼^(guò)量表達(dá)青蒿中青蒿素合成途徑關(guān)鍵酶基因的方法。通過(guò)單基因或多基因過(guò)表達(dá)等方法,成功提高了青蒿中青蒿素含量。(ⅱ)阻斷策略:通過(guò)反義抑制或RNAi干擾等方法抑制競(jìng)爭(zhēng)支路基因表達(dá)的方法,該團(tuán)隊(duì)成功阻斷鯊烯合酶基因SQS、β-石竹烯合酶基因CPS、β-法尼烯合酶基因BFS等基因,提高了青蒿中青蒿素的含量,并發(fā)現(xiàn)阻斷BFS和SQS基因效果更佳。(ⅲ)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略:通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用,該團(tuán)隊(duì)成功獲得多個(gè)正調(diào)控青蒿素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子,包括腺毛特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 AaORA(AP2/ERF家族)、茉莉酸響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Aa-MYC2(bHLH家族)以及AaORA-AaTCP14復(fù)合體等。(ⅳ)間接調(diào)控策略:通過(guò)調(diào)控植物激素的合成、光信號(hào)途徑、低溫誘導(dǎo)因子等間接調(diào)控青蒿素的生物合成等。(ⅴ)增加分泌型腺毛策略:通過(guò)增加青蒿葉片表面分泌型腺毛密度的方法,成功鑒定了包括 AaHD1,AaHD8和 AaMIXTA等在內(nèi)的多個(gè)與腺毛發(fā)育相關(guān)的調(diào)控因子。(ⅵ)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白策略:通過(guò)加速底物轉(zhuǎn)運(yùn)從而提高青蒿素生物合成的方法,該研究團(tuán)隊(duì)鑒定了多個(gè)青蒿 PDR(pleiotropic drug resistance)類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

    丹參為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物。因其根形似人參、皮紅如丹,故名丹參,為大宗常用中藥材。丹參根富含丹參酮二萜類化合物及丹酚酸等酚酸類化合物,這些化合物在心血管疾病預(yù)防和治療中具有較好的活性功能。丹參易于遺傳轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)周期較短、易于栽培種植,其基因組大小為620 Mb左右。中國(guó)科學(xué)院藥用植物研究所陳士林研究組與中國(guó)科學(xué)院植物研究所漆小泉研究組合作完成了丹參全基因組框架圖,為發(fā)展丹參為藥用植物模式實(shí)驗(yàn)材料提供了條件,極大地推動(dòng)了我國(guó)藥用植物分子生物學(xué)研究。

    丹參酮為丹參中的特征性二萜醌類化合物。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所黃璐琦研究組與合作者利用前期的芯片數(shù)據(jù)鑒定了兩個(gè)參與丹參酮生物合成的二萜合酶SmCPS1和SmKSL1,酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,其產(chǎn)物為丹參酮類化合物前體次丹參酮二烯。隨后該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步克隆鑒定3個(gè)細(xì)胞色素P450基因——CYP76AH1,CYP76AH3和CYP76AK1,將丹參酮生物合成途徑從次丹參酮二烯推向鐵銹醇和更為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)途徑,與中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究組合作,實(shí)現(xiàn)了丹參酮已知途徑中間體在酵母工程菌中的高效生產(chǎn),其中次丹參酮二烯的產(chǎn)量高達(dá)365 mg/L。

    漆小泉研究組對(duì)丹參全基因組范圍內(nèi)的二萜合酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)丹參具有4條二萜生物合成途徑,包括在根和地上部分別合成丹參酮的途徑、花瓣中的一個(gè)全新的淚柏醚(ent-13-epi-manoyl oxide)合成和保守的赤霉素合成途徑;并發(fā)現(xiàn)唇形科中normal-CPP型二萜合酶的快速進(jìn)化受到正向選擇的作用。

    丹酚酸類化合物是丹參中另一類重要的活性成分。第二軍醫(yī)大學(xué)陳萬(wàn)生研究組利用同位標(biāo)記動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法對(duì)迷迭香酸生源途徑進(jìn)行了評(píng)估,推測(cè)了其主要合成途徑,克隆鑒定了一系列參與迷迭香酸的基因。最后通過(guò)全基因組分析,得到兩個(gè)漆酶(SmLAC7和SmLAC20),推測(cè)其參與了丹酚酸B的生物合成。

    近年來(lái),我國(guó)植物代謝領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速,大量年輕的科研人員投身到植物代謝研究,研究隊(duì)伍在不斷壯大,已經(jīng)在植物代謝領(lǐng)域的多個(gè)研究方向取得了具有潛在影響力的成績(jī),相信在今后5~10年內(nèi)必將獲得一批具有重要國(guó)際影響力的成果。

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