外泌體介導(dǎo)阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展

楊琪潔 廖鑫鑫 肖婷婷 沈璐

1 背景

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是最為常見的變性病 性癡呆類型，占所有癡呆病例的60%至80%。它的臨床特征是起病隱匿，進(jìn)行性惡化，以認(rèn)知功能受損為核心，伴隨精神行為癥狀且逐漸出現(xiàn)日常生活能力的受損。AD 病理學(xué) 特征是神經(jīng)元外老年斑（amyloid plaques）沉積、神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）及神經(jīng)元變性壞死。

關(guān)于AD 發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要有根據(jù)β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）異常聚集提出的Aβ 假說和根據(jù)NFTs 病理特點(diǎn)提出的Tau 假說。隨著AD 的疾病進(jìn)展，人們可以觀察到老年斑和NFTs 在皮質(zhì)中按照相對固定的模式擴(kuò)散，由此有人提出AD “朊蛋白樣機(jī)制”，即病理性的蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞-細(xì)胞之間傳播，從而導(dǎo)致疾病的擴(kuò)散。據(jù)報(bào)道，外泌體在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏏D，帕金森病和朊病毒疾?。┑牟±硇缘鞍讉鞑ブ邪l(fā)揮作用。在這篇綜述中，我們將討論外泌體在APP 和tau 蛋白的代謝和分泌中的作用以及對AD 發(fā)病機(jī)制的影響。

2 外泌體的形成與組成

外泌體是一種直徑50～100 nm的膜性囊泡，機(jī)體的大多數(shù)細(xì)胞都可分泌。外泌體的形成過程大致為：首先，從早期內(nèi)體到晚期內(nèi)體成熟的過程中，內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷發(fā)芽并斷裂形成多個(gè)包繞細(xì)胞內(nèi)成分的腔內(nèi)囊泡（Intraluminal vesicles，ILVs），在這個(gè)過程中諸如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA 等分子被包裹到泡腔之中，這導(dǎo)致晚期內(nèi)體呈現(xiàn)多泡狀外觀，因此根據(jù)它的形態(tài)特征，晚期內(nèi)體又稱為多泡體（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs 有兩種不同的命運(yùn)，一部分MVBs 通過與溶酶體融合，將其內(nèi)容物進(jìn)行降解；而另一部分 MVBs 則與細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)在的ILVs 分泌出細(xì)胞，ILVs 最終形成外泌體。

外泌體主要由兩種類型分子組成：結(jié)構(gòu)分子和貨物分子。無論外泌體來源于何種細(xì)胞類型，其結(jié)構(gòu)分子是特有的，并且對維持外泌體的基本結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。外泌體通過內(nèi)體通路釋放，所以外泌體中都包含Tetraspanins 蛋白（CD9，CD63，CD81 和CD82），Rab GTPases，flotillin，Alix，TSG101和熱休克蛋白（Hsc70，Hsp90）等蛋白質(zhì)。貨物分子，即通過外泌體運(yùn)輸?shù)闹|(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等。不同細(xì)胞來源的外泌體攜帶不同的蛋白質(zhì)。例如，主要組織相容性復(fù)合物II 類（MHCII）主要源自抗原呈遞細(xì)胞的外泌體中。細(xì)胞還可以在不同的病理和生理?xiàng)l件下通過外泌體釋放朊病毒，β-淀粉樣蛋白肽，tau 蛋白，錯(cuò)誤折疊的超氧化物歧化酶-1（SOD1）和α-突觸核蛋白。外泌體中脂質(zhì)成分的主要作用是調(diào)節(jié)小RNA 和蛋白質(zhì)的外泌體分選。除蛋白質(zhì)和脂肪外，外泌體還負(fù)責(zé)遺傳物質(zhì)的運(yùn)輸，如DNA，mRNA，miRNA，核糖體RNA（rRNA），環(huán)狀RNA 和長非編碼RNA（lnRNA）等。其中，miRNA（＜30 個(gè)核苷酸）占所有外泌體RNA 的50%以上。然而，也有研究認(rèn)為核糖體 RNA（rRNA），特別是28S 和18S rRNA亞基是外泌體中主要RNA。這可能是由于外泌體提取純度和細(xì)胞來源的不同導(dǎo)致的。

3 外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用

外泌體具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育、再生和突觸功能的作用，更使人感興趣的是，外泌體可以介導(dǎo)神經(jīng)變性疾病相關(guān)的錯(cuò)誤折疊蛋白在細(xì)胞-細(xì)胞之間的傳遞。細(xì)胞釋放外泌體，一方面可以將細(xì)胞內(nèi)多余的物質(zhì)排出，另一方作為信使介導(dǎo)細(xì)胞間的交流。外泌體既可在鄰近細(xì)胞間傳播，也可以隨體液分布作用于遠(yuǎn)隔組織。外泌體介導(dǎo)信號傳遞有以下途徑：（1）通過與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合，直接注入其內(nèi)物質(zhì)于靶細(xì)胞之中。（2）利用靶細(xì)胞的內(nèi)吞或吞噬作用，直接將外泌體攝入細(xì)胞內(nèi)。（3）外泌體與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合，從而進(jìn)行信息傳遞。在CNS 中，大多數(shù)細(xì)胞均能釋放外泌體，例如神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊具有高效性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞選擇性。外泌體介導(dǎo)AD 發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究將在后文重點(diǎn)論述。

4 外泌體與Aβ

Aβ 由淀粉樣前體蛋白（amyloid β precursor protein，APP）水解產(chǎn)生，長度從36 到43 個(gè)氨基酸不等。APP有兩種切割方式，即淀粉樣和非淀粉樣水解。前者APP 首先經(jīng)β-分泌酶（BACE-1）水解，生成大的可溶性胞外片段（sAPP-β）和膜結(jié)合C末端片段（β-CTF），后者再被γ-分泌酶水解生成APP 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（APP intracellular fragment，AICD）和Aβ；Aβ 主要被釋放到胞外，聚集成寡聚體（Oligomer）和纖絲體（Fibrils）。寡聚體被認(rèn)為是最具毒性的Aβ 形式，纖絲體則是老年斑的主要成分。在非淀粉樣蛋白生成途徑中，α-分泌酶則在Aβ 結(jié)構(gòu)域的第16 和17 位氨基酸之間將APP 蛋白水解為sAPPα 和α-CTF 兩部分，α-CTF 進(jìn)一步被γ-分泌酶水解，生成AICD 和可溶性的p3，從而減少Aβ 的產(chǎn)生。BACE-1 是Aβ 生成的關(guān)鍵酶，它主要在高爾基網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)體這些酸性細(xì)胞器中發(fā)揮水解酶功能。APP 的淀粉樣蛋白生成途徑也主要發(fā)生在早期內(nèi)體。既然如此，那sAPP-β，APP，BACE-1 和Aβ 是否也存在于內(nèi)體來源的外泌體中呢？近年來，科學(xué)家們進(jìn)行了這方面的探索，不僅證實(shí)Aβ 可以通過外泌體運(yùn)輸，而且在外泌體中也發(fā)現(xiàn)了APP 切割的關(guān)鍵成分（BACE、PS1、PS2 和ADAM10），提示外泌體可能是APP 水解的另一場所。

然而，外泌體在AD 疾病進(jìn)展中的作用仍存在爭議。一部分學(xué)者認(rèn)為外泌體可能推動(dòng)AD 進(jìn)展。最近的研究結(jié)果表明Aβ 的毒性寡聚體（Aβ oligomers，oAβ）可能以類似朊病毒的方式引起病理學(xué)傳播，盡管其基本機(jī)制尚不完全清楚。Maitrayee Sinha 等的研究顯示AD 患者大腦外泌體oAβ 水平增高；體外實(shí)驗(yàn)中，oAβ 寡聚體可通過外泌體在神經(jīng)元與神經(jīng)元之間傳播；通過阻斷外泌體的形成、分泌或攝取會降低Aβ 寡聚體的擴(kuò)散和相關(guān)的毒性。Yuyama等發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性AD 患者的腦中觀察到神經(jīng)元中的內(nèi)吞途徑損傷，包括早期內(nèi)體的增大和Rab5 的上調(diào)。這種損傷使含有GM1 神經(jīng)節(jié)苷脂的外泌體的釋放，并誘導(dǎo)了淀粉樣蛋白原纖維的形成。Wang 等發(fā)現(xiàn)，Aβ可誘導(dǎo)富含PAR-4 和C18 神經(jīng)酰胺的外泌體的分泌，后者進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡。相反，也有部分研究認(rèn)為外泌體具有神經(jīng)保護(hù)功能，N2a分泌的外泌體能阻止Aβ 單體聚集成寡聚體、減少Aβ 誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、增加小膠質(zhì)細(xì)胞清除的Aβ 能力以及在溶酶體降解過程。細(xì)胞朊蛋白[PrP（C）]，作為一種在外泌體上高度表達(dá)的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定表面糖蛋白，通過其N-末端與低聚Aβ 緊密結(jié)合，加速淀粉樣蛋白β 的纖維化，從而減少低聚Aβ 神經(jīng)毒性作用。簡言之，外泌體可能在Aβ 代謝通路中起到雙刃劍的作用。

5 外泌體與Tau

NFTs 由神經(jīng)元內(nèi)過度磷酸化的tau 蛋白聚集形成。在AD 中，tau蛋白病理過程遵從Braak 分級學(xué)說，最先出現(xiàn)在內(nèi)嗅皮質(zhì)及其周邊區(qū)域（Braak 階段I-II），隨后出現(xiàn)在海馬和杏仁核，累及皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)（Braak階段III-IV），最終侵犯新皮質(zhì)區(qū)域（Braak 階段V 和IV）。人類大腦中病理性tau 蛋白擴(kuò)散機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。有越來越多的證據(jù)表明病理性tau 蛋白類似“種子”，以“類朊病毒樣機(jī)制”擴(kuò)散和復(fù)制，受體細(xì)胞攝取這些“種子”導(dǎo)致自體內(nèi)單體tau 的錯(cuò)誤折疊繼而聚集。大腦中病理性tau 蛋白擴(kuò)散的前提是這些類似“種子”的tau 蛋白能在神經(jīng)元細(xì)胞之間傳播。Tau 蛋白自身并沒有分泌信號肽，外泌體介導(dǎo)的分泌途徑可能在這一進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。Wang 等發(fā)現(xiàn)含有tau 蛋白的外泌體可通過軸突運(yùn)輸至突觸前膜，并釋放至突觸間隙，然后通過突觸連接被下一級神經(jīng)元突觸后膜內(nèi)化吸收。如此傳遞，導(dǎo)致tau 蛋白在神經(jīng)元中傳播。Sudad Saman 等在M1C 神經(jīng)母細(xì)胞瘤tau 蛋白病模型中發(fā)現(xiàn)，tau 蛋白能以外泌體形式分泌出，其中包含有早期AD 標(biāo)志物（AT270）。在人腦脊液樣本中發(fā)現(xiàn)tau 蛋白相關(guān)的外泌體。AD 患者血漿神經(jīng)來源外泌體中磷酸化Tau 蛋白的水平顯著高于正常對照。有關(guān)證據(jù)表明，只有tau 蛋白病理性聚集的細(xì)胞才能分泌具有種子活性 tau蛋白的外泌體，其中磷酸化tau 及寡聚體tau 被認(rèn)為是具有種子活性。Polanco 及其同事利用rTg4510 小鼠 證明，只有作為“種子”的tau 蛋白在細(xì)胞內(nèi)到達(dá)一定濃度時(shí)才能使細(xì)胞內(nèi)tau 蛋白聚集，即閾值依賴的形式。由于外泌體中僅含有少量的“種子”tau 蛋白，當(dāng)其緩慢積累到活性閾值時(shí)，才能引起細(xì)胞內(nèi)tau 蛋白聚集，這可能可以解釋AD 進(jìn)展緩慢。

6 外泌體與 AD 的診斷與治療

通過分離神經(jīng)元來源的外泌體（Neuron-derived exosomes，NDEs），研究者發(fā)現(xiàn)其內(nèi)多種蛋白質(zhì)可作為AD 的潛在生物標(biāo)志物，其大致可分為3 類。① Aβ 病理相關(guān)蛋白，如Aβ、BACE-1、突觸蛋白等，這些提示突觸變性。② 葡萄糖代謝相關(guān)蛋白，如Akt 信號通路、MAPK 信號通路、mTOR 信號通路。③ Tau 病理相關(guān)蛋白，如總tau、p181-Tau、P396-Tau、輕鏈蛋白（NF-1）、溶酶體蛋白等。此外，外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種miRNA 也是AD 的潛在生物標(biāo)志物，多個(gè)研究表明在AD 患者腦組織及腦脊液來源的外泌體中，NF-κB誘導(dǎo)型miRNA 家族表達(dá)上調(diào)，如miRNA-9， miRNA-34a，miRNA- 125b，miRNA-146a 和miRNA-155等，這些miRNAs 進(jìn)一步調(diào)控下游先天免疫和炎癥信號，影響線粒體能量代謝等。

通過對這些標(biāo)志物及其通路的深入研究，可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AD 治療的新靶點(diǎn)，如可通過改變各種激酶和蛋白酶的活性、調(diào)控興奮性突觸蛋白的水平及細(xì)胞因子等方式來治療AD。另一方面神經(jīng)退行性疾?。ㄈ鏏D）的發(fā)生多與大腦內(nèi)微環(huán)境改變有關(guān)，可以通過外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間信息交流調(diào)節(jié)大腦微環(huán)境進(jìn)而調(diào)整AD 疾病的進(jìn)展。有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）來源的外泌體有希望成為是AD 治療的新工具，其包含的生物活性分子有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)及清除Aβ及oAβ 的功能，從而重塑突觸功能、阻止神經(jīng)細(xì)胞死亡及減慢AD 患者記憶力下降。外泌體可以在CNS 和外圍循環(huán)之間交換，通過血腦屏障，經(jīng)修飾的外泌體可以形成向特定神經(jīng)元輸送的獨(dú)特藥物系統(tǒng)。

7 結(jié)語

綜上所述，外泌體一方面能促進(jìn)Aβ、tau 蛋白的聚集、擴(kuò)散，從而造成神經(jīng)元死亡，促進(jìn)AD 的進(jìn)展，另一方面，外泌體又具有一定程度的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，外泌體獨(dú)有的生物學(xué)特點(diǎn)使其成為AD 診斷與治療的新靶點(diǎn)。因此，進(jìn)一步探索外泌體與AD 之間的聯(lián)系具有重要意義?！?/p>