非洲豬瘟病毒免疫逃逸相關(guān)蛋白研究進(jìn)展

王西西 陳青 陳鴻軍 朱鴻飛 李金祥 郭曉宇

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，AS-FV）是一種核質(zhì)大DNA病毒，在病毒分類中隸屬于DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，為該病毒科唯一成員。ASFV具有雙層囊膜結(jié)構(gòu)，病毒基因組為線性雙鏈DNA分子，不同毒株基因組大小存在一定差異，總體介于170～190 kb之間，可編碼150多個(gè)開放閱讀框，成熟病毒粒子中含有50種以上結(jié)構(gòu)蛋白。

巨噬細(xì)胞是 ASFV感染的主要靶細(xì)胞，病毒主要通過肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞，隨后病毒內(nèi)層囊膜與次級(jí)內(nèi)體融合，病毒核心被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。ASFV主要在巨噬細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制、組裝及子代病毒顆粒的釋放，病毒表達(dá)自身DNA聚合酶、連接酶和核酸內(nèi)切酶等保證復(fù)制的準(zhǔn)確性。已有研究表明，ASFV基因組可編碼多種蛋白質(zhì)，用以調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調(diào)控細(xì)胞周期等，從而抑制和逃避宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為自身增殖、擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。ASFV編碼的免疫逃逸蛋白按功能主要分為以下幾類：① 調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)及細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，如DP71L和A238L等；② 抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路，如多基因家族蛋白 MGF360、MGF505/530和 I329L等；③ 調(diào)控細(xì)胞程序性死亡，包括p54、A179L、A224L和EP153R等；④ 其他免疫抑制蛋白，如CD2v、L83L等。

1 病毒蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)

1.1 DP71L

DP71L基因位于ASFV基因組右側(cè)可變區(qū)，緊鄰 ASFV毒力基因DP96R，是高度保守的晚期表達(dá)蛋白。大部分ASFV毒株的DP71L蛋白為短鏈（DP71Ls/NL-S，70～72個(gè)氨基酸），其他一些分離株（如ASFV Malawi Lil-20/1和pig/Kenya/KEN-50/1950毒株）的DP71L為長(zhǎng)鏈蛋白（DP71Ll，184～185個(gè)氨基酸）。NL-S蛋白氨基酸序列同源性為94%～100%，DP71Ll蛋白118～185位氨基酸與NL-S蛋白7～71位氨基酸序列的同源性為 61%。NL-S和 DP71Ll都具有的保守 C端結(jié)構(gòu)域，與單純皰疹病毒毒力蛋白ICP34.5和生長(zhǎng)抑制DNA損傷蛋白34（GADD34）的同源性為30%～40%。

eIF2是一種通用的真核翻譯因子，是由α、β和γ亞基組成的異源三聚體，在病毒感染或蛋白質(zhì)應(yīng)激（ERS）等刺激發(fā)生時(shí)α亞基在eIF2激酶作用下發(fā)生磷酸化修飾，引起蛋白翻譯受阻。ASFV編碼的免疫逃逸蛋白NL-S和DP71Ll蛋白可募集蛋白磷酸酶 1（PP1），使翻譯起始因子2α（eIF2α）去磷酸化以恢復(fù)蛋白合成，從而使得病毒利用細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)自身蛋白。

ASFV利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）進(jìn)行蛋白表達(dá)與修飾，大量病毒蛋白表達(dá)造成未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）。持久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活peIF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路，使細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡程序。而ASFV表達(dá)的DP71L通過促進(jìn)eIF2α去磷酸化，抑制 peIF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路的激活及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖。

ASFV E70缺失DP71L基因后對(duì)宿主的毒力明顯下降，缺失病毒感染豬后除了短暫的發(fā)熱反應(yīng)沒有出現(xiàn)其他臨床癥狀，血液中病毒滴度能夠降低1000倍，所有接種動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡。然而 ASFV Malawi Lil-20/1毒株（Mal）缺失DP71L基因后，在家豬中的致死率仍達(dá)100%；ASFV Pretoriuskop/96/4毒株（Pr4）缺失DP71L基因后，能夠延遲家豬接種后出現(xiàn)病毒血癥及死亡的時(shí)間，但致死率仍然很高。以上研究表明：DP71L基因是ASFV非必需毒力基因，Mal和 Pr4缺失 DP71L基因后仍有其他補(bǔ)償性基因以維持病毒毒力。

1.2 A238L

A238L為ASFV早期表達(dá)蛋白，分子量大小約為28 kD，含有226～239個(gè)氨基酸，是ASFV在巨噬細(xì)胞中復(fù)制的非必需蛋白。A238L包含一個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（Ankyrinrepeat，ANK），為IkappaB蛋白同系物，與豬IκBα因子同源性為40%。A238L能夠抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而抑制促炎性因子的表達(dá)，并調(diào)控NF-κB通路下游一氧化氮合酶、粘附分子和補(bǔ)體因子等蛋白的表達(dá)與活化。ASFVE-70毒株缺失A238L基因后，感染豬PBMC可誘導(dǎo)TNF-α顯著上調(diào)表達(dá)。A238L通過其結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin，CN）底物結(jié)合位點(diǎn)，抑制CN與底物結(jié)合，進(jìn)而抑制CN對(duì)T細(xì)胞核因子蛋白（NFAT）進(jìn)行脫磷酸化，阻礙 NFAT向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)對(duì)生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用。此外，A238L蛋白抑制 iNOS啟動(dòng)子活性，下調(diào)iNOS表達(dá)及其誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。

2 病毒蛋白抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路

2.1 多基因家族蛋白MGF360、MGF530/505

ASFV基因組結(jié)構(gòu)分為左右兩側(cè)可變區(qū)和中央保守區(qū)，中央保守區(qū)幾乎不出現(xiàn)大片段的插入和缺失突變，左右兩側(cè)可變區(qū)內(nèi)串聯(lián)排列的多基因家族基因在不同的毒株中具有不同的拷貝數(shù)和互補(bǔ)性。位于可變區(qū)的多基因家族蛋白主要分為5種：MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，在不同的毒株中MGFs具有不同的拷貝數(shù)和序列多樣性。與痘病毒類似，ASFV基因組多樣性來源于兩端基因組的多樣性，通?；蚪M兩側(cè)可變區(qū)的基因?qū)Σ《倔w外增殖是非必需的，而是參與抑制宿主Ⅰ型干擾素（Interferon，IFN）產(chǎn)生和調(diào)控促炎性細(xì)胞因子表達(dá)等功能。

已有研究表明，MGF360、530/505能夠抑制I型干擾素表達(dá)，同時(shí)抑制干擾素的抗病毒效應(yīng)，并通過延長(zhǎng)感染細(xì)胞的存活時(shí)間來提高病毒在宿主細(xì)胞中的增殖效率和數(shù)量。MGF360家族成員A276R可以抑制Poly（I：C）刺激的I型干擾素上調(diào)表達(dá)，而對(duì) I型和 II型干擾素誘導(dǎo)的JAK-STAT途徑和NF-κB信號(hào)通路沒有抑制作用。MGF505家族成員A528R可以抑制Poly（I：C）刺激的IFN誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對(duì)I型和II型干擾素誘導(dǎo)的JAK-STAT途徑具有抑制作用。ASFV弱毒株OURT88/3缺失MGF360-10L、11L、12L、13L、14L和MGF530/505-1R、2R及部分MGF530/505-3R后，與母本病毒相比，MGF基因缺失毒株可以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN，且可提供針對(duì)同源基因I型和其他基因型的攻毒保護(hù)。AS-FV強(qiáng)毒或弱毒株缺失MGF360和530/505后在巨噬細(xì)胞或軟蜱體內(nèi)的復(fù)制效率下降，病毒毒力下降，免疫動(dòng)物后可以提供針對(duì)同源病毒或部分異源病毒的保護(hù)力。

2.2 I329L

I329L蛋白是ASFV晚期蛋白，含有329個(gè)氨基酸，序列相對(duì)保守。I329L為高度糖基化的 I型跨膜蛋白，分布于感染細(xì)胞的細(xì)胞膜以及病毒囊膜表面。I329L包含信號(hào)肽（1～17 aa）、N-末端的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（18～239 aa），跨膜結(jié)構(gòu)域（240～260 aa）和 C末端的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（氨基酸261～329 aa）。ASFV I329L為TLR家族蛋白同系物，其胞內(nèi)區(qū)氨基酸序列與TLR3的BOX1和BOX2序列相似性可達(dá) 35%，胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR），LRR在幾種 TLRs中均有存在，是蛋白質(zhì)之間相互作用的重要基序。

研究表明，I329L可拮抗TLR3介導(dǎo)的固有免疫激活，抑制dsRNA/Poly（I：C）刺激后誘導(dǎo)的NF-κB和 IRF3信號(hào)通路。TRIF是TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，是I329L調(diào)控免疫系統(tǒng)的靶蛋白。對(duì)I329L的構(gòu)象研究表明，該蛋白能夠抑制接頭分子TRIF的活性，進(jìn)而阻斷TRIF介導(dǎo)的 IRF3和 NF-κB激活以及下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，過表達(dá)TRIF可以逆轉(zhuǎn)I329L的抑制作用。

3 病毒蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡

3.1 病毒蛋白抑制細(xì)胞凋亡

3.1.1 A179LA179L蛋白在病毒感染早期和晚期均有表達(dá)，分子量大小約為18 kD，含有179個(gè)氨基酸，在不同的ASFV毒株中A179L序列高度保守。A179L是Bcl-2家族成員之一，具有Bcl-2家族成員保守結(jié)構(gòu)域 BH1、BH2、BH3和 BH4，但缺少相應(yīng)跨膜結(jié)構(gòu)域。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，主要分為兩大類：一類抗細(xì)胞凋亡，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等；一類促進(jìn)細(xì)胞凋亡，主要包括Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。

研究表明，A179L主要定位在線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在多種細(xì)胞系中表達(dá)A179L后均能抑制細(xì)胞凋亡。例如，A179L抑制p68誘導(dǎo)的HeLa和BSC-40細(xì)胞凋亡，以及大分子誘導(dǎo)的BSC-40細(xì)胞凋亡。A179L能夠抑制重組桿狀病毒感染單層生長(zhǎng)昆蟲細(xì)胞而非懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，表明A179L抗細(xì)胞凋亡活性可能與細(xì)胞錨定特性有關(guān)。

Galindo等證明A179L可以與促凋亡的僅表達(dá)BH3的截短活性蛋白Bidp13和p15相互作用，抑制其活性；A179L還可以與促凋亡蛋白家族的其他蛋白如 Bad、Bmf、Bik和Bim等相互作用，形成異源二聚體，使得細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序。此外，A179L還通過與 Beclin-1互作調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，并抑制饑餓條件誘導(dǎo)的自噬體的形成。

3.1.2 A224LA224L蛋白具有224個(gè)氨基酸，在不同的AS-FV毒株中序列相對(duì)保守，同源性為90%～99%。A224L在ASFV感染細(xì)胞晚期表達(dá)，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族蛋白成員。IAPs是內(nèi)源性抑制細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)家族，其顯著結(jié)構(gòu)特征是均具有1～3個(gè)桿狀病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)（baculorius IAP repeat，BIR）結(jié)構(gòu)域。人的IAPs包括XIAP和cIAP1等，XIAP與caspase-9、caspase-3和caspase-7相互作用，抑制它們的活化以及其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)A224L蛋白能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的caspase3激活及細(xì)胞凋亡，具體機(jī)制涉及對(duì)caspase-3蛋白水解的抑制，可能通過A224L與caspase-3蛋白水解片段的直接互作，從而干擾細(xì)胞凋亡路徑，促進(jìn)ASFV感染細(xì)胞的存活。Vero細(xì)胞感染A224L基因缺失病毒后，caspase-3的蛋白水解作用顯著增加。此外，有研究表明細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)A224L后能激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κB具有抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖的功能，對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖具有促進(jìn)作用。ASFV在不同感染時(shí)期對(duì) NF-κB具有不同的調(diào)控機(jī)制。在病毒感染早期，ASFV表達(dá)A238L對(duì)NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用；隨著感染進(jìn)程的推進(jìn)，ASFV表達(dá)晚期蛋白A224L，激活NF-κB通路并抑制caspase活性及細(xì)胞凋亡。

3.1.3 EP153REP153R編碼含有153～163個(gè)氨基酸的凝集素類似膜蛋白，EP153R與一些C型凝集素分子的 N-端結(jié)構(gòu)域具有同源性。EP153R在病毒感染期間的早期和晚期均具有表達(dá)，為病毒在細(xì)胞增殖的非必需蛋白。EP153R含有中央跨膜區(qū)，C型凝集素樣結(jié)構(gòu)（C-type lectin）和細(xì)胞附著序列，蛋白中潛在多個(gè)N-糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位點(diǎn)。

EP153R蛋白為多功能蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡，抑制MHC-I表達(dá)，且參與 ASFV感染細(xì)胞后的血細(xì)胞吸附過程。用缺失EP153R基因后的ASFV BA71V毒株感染細(xì)胞，caspase-3表達(dá)水平及細(xì)胞死亡量顯著增加。在Vero或Cos細(xì)胞中過表達(dá)EP153R后，p53蛋白的反式激活活性受到抑制，進(jìn)而抑制星形孢菌素或病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Hurtado C等模擬了EP153R的3D結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)EP153R的二聚體可能與MHC-I分子具有相互作用。過表達(dá)和病毒感染實(shí)驗(yàn)表明，EP153R抑制MHC-I的表達(dá)，主要通過抑制MHC-I從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的胞外分泌過程，而不是影響MHC-I的表達(dá)及成熟過程。用缺失 EP153R的NH/P68毒株免疫動(dòng)物后29 d后，可以提供針對(duì)同源病毒AS-FVL60的免疫攻毒保護(hù)。

3.2 感染后期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

3.2.1 E183L E183L基因編碼含有183～197個(gè)氨基酸的ASFV膜蛋白p54。p54為ASFV結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒粒子組裝，以及病毒粘附宿主細(xì)胞過程。過表達(dá) ASFVE183L基因，可促進(jìn) caspase-3蛋白表達(dá)及核斷裂，進(jìn)而促進(jìn)其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。p54包含一個(gè)含有13個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，通過與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白輕鏈相互作用，實(shí)現(xiàn)病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)；這些氨基酸序列與僅表達(dá)BH3的促凋亡蛋白的Bim結(jié)構(gòu)域具有一定相似性，缺失該結(jié)構(gòu)域后，p54便失去誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

4 病毒其他免疫抑制蛋白

4.1 CD2v

CD2v是ASFV晚期表達(dá)蛋白，在ASFV感染的細(xì)胞中，CD2v具有三種表達(dá)形式，分別為89kD的全長(zhǎng)糖基化蛋白，及通過蛋白水解作用產(chǎn)生的大小約為63kD的N-末端糖基化片段和大小約為26 kD的C-末端非糖基化片段。ASFVCD2v與 T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)的CD2結(jié)構(gòu)與功能類似。CD2v蛋白能夠?qū)е录t細(xì)胞吸附于病毒感染細(xì)胞表面，有助于其在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散。此外CD2v具有抑制有絲分裂原刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用，具體機(jī)制可能是通過CD2v細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與淋巴細(xì)胞表面配體的直接相互作用，或通過CD2v細(xì)胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)蛋白相互作用而介導(dǎo)。EP153R與CD2v為相鄰基因，缺失EP153R后病毒在細(xì)胞中的增殖不受到影響，但ASFV感染細(xì)胞所導(dǎo)致的血細(xì)胞吸附現(xiàn)象基本消失。缺失CD2v后的BA71毒株接種家豬后無明顯臨床感染癥狀，可以保護(hù)接種豬免受母本病毒的攻擊，還可以提供針對(duì)E75（基因I型）以及 Georgia2007/1（基因 II型）強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)。

4.2 L83L

L83L為ASFV早期表達(dá)蛋白，含有一個(gè)保守的異戊烯化基序，是病毒在巨噬細(xì)胞復(fù)制的非必需蛋白。L83L能夠特異性結(jié)合IL-1β，抑制其抗病毒反應(yīng)。Georgia 2007/1毒株缺失L83L基因后在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力無明顯變化，且基因缺失毒株具有與親本 Georgia 2007/1相似的致病力。

5 討論

針對(duì)入侵病原，機(jī)體進(jìn)化出一系列高度復(fù)雜的免疫機(jī)制以預(yù)防和清除病原體。非洲豬瘟病毒（ASFV）是大DNA病毒，在巨噬細(xì)胞內(nèi)快速增殖，進(jìn)而擴(kuò)散至全身，導(dǎo)致家豬在感染后 2～10 d內(nèi)發(fā)病死亡。ASFV通過自身蛋白采用多種免疫逃逸機(jī)制以確保病毒的繁殖與擴(kuò)散，從 ASFV毒株中缺失相關(guān)基因后，有助于構(gòu)建具有良好免疫原性和保護(hù)力的多基因工程缺失疫苗。抑制 I型 IFN的產(chǎn)生及其抗病毒效應(yīng)對(duì)于促進(jìn)ASFV增殖至關(guān)重要，不同基因型的ASFV毒株缺失部分MGF360/505基因后，病毒毒力顯著減弱。目前，對(duì)于多基因家族蛋白的作用機(jī)制及是否存在其他病毒蛋白抑制 I型 IFN信號(hào)通路仍是ASFV免疫逃逸機(jī)制研究的熱點(diǎn)。

ASFV的p54結(jié)構(gòu)蛋白是重要的促凋亡因子，在感染細(xì)胞早期即可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但不利于病毒增殖，因此 ASFV感染初期表達(dá)多種抑制凋亡蛋白，如A179L、A224L、EP153R和DP71L等。延長(zhǎng)感染巨噬細(xì)胞的存活及促進(jìn)臨近淋巴細(xì)胞的凋亡是ASFV完成增殖及免疫逃逸的重要機(jī)制，但ASFV如何調(diào)控自身蛋白表達(dá)，如何維持促進(jìn)細(xì)胞凋亡與抗凋亡的平衡以完成病毒復(fù)制，以及如何在感染后期引起大量未感染淋巴細(xì)胞及非淋巴組織細(xì)胞的凋亡是今后研究中的重點(diǎn)。

ASFV具有復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，編碼表達(dá)大量病毒復(fù)制非必需蛋白，這些蛋白的功能是什么?有些病毒蛋白具有相似功能，它們對(duì)病毒免疫逃逸和致病力有哪些影響？哪些細(xì)胞受體和宿主蛋白與病毒蛋白產(chǎn)生相互作用？這些問題仍有待進(jìn)一步研究。深入研究ASFV病毒免疫逃逸機(jī)制必將有助于了解ASFV的致病機(jī)理，并對(duì)疫苗開發(fā)和疾病防控提供指導(dǎo)作用。

（摘自《病毒學(xué)報(bào)》2018年第6期）