首例基于CRISPR編輯干細(xì)胞的基因治療

■文/曲喜英 王鵬飛

作為先進、熱門的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9首次在人的造血干細(xì)胞中完成對CCR5基因的編輯，并將其成功移植到罹患艾滋病和急性淋巴細(xì)胞白血病的患者體內(nèi)。這是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在治療艾滋病的道路上邁出的重要一步，同時為探索CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療其他血液疾病提供了重要的參考和指導(dǎo)意義。

宣判“死刑”的艾滋病被判“無期”

自從1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病，人們不只是避而遠(yuǎn)之，甚至達(dá)到了“談艾色變”的惶恐程度，因為這場給全球帶來“世紀(jì)大瘟疫”的傳染和流行性疾病在早期醫(yī)學(xué)上是被宣判為“死刑”的。人們只要得了艾滋病，幾乎等同于人的一生會被毀掉。1983年，艾滋病病毒——人類免疫缺陷病毒（HIV）——被分離并被確定為艾滋病病原體，為逆轉(zhuǎn)錄病毒中的一種，主要分為兩型：HIV-1與HIV-2。艾滋病主要是由HIV-1感染所引起的。HIV-1感染人體后會整合于人體細(xì)胞的基因組中，通過人體細(xì)胞的基因組復(fù)制系統(tǒng)完成自身的復(fù)制，最終導(dǎo)致人體的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重的破壞。因此，艾滋病給社會帶來了莫大的恐慌。

華裔科學(xué)家何大一首創(chuàng)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART），俗稱“雞尾酒療法”，使得一種被早期醫(yī)學(xué)宣判為“死刑”的可怕疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可治療、可控制的慢性疾病。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法通過3種或3種以上的抗病毒藥物聯(lián)合使用來治療艾滋病，最大限度地抑制艾滋病病毒的復(fù)制，使患者被破壞的免疫功能逐漸恢復(fù)，從而延緩患者的病程進展、延長患者的生命，為艾滋病患者的治療贏得更多的時間。何大一的這一工作給處在黑暗邊緣的艾滋病患者帶來了曙光，讓這些垂死掙扎的患者重拾了生活的信心。何大一因為這一震驚世界的療法，成為風(fēng)靡全球的“打敗艾滋病”的科學(xué)名人，被《時代》周刊選為“1996年度風(fēng)云人物”。但是，何大一明白，即使抗病毒藥物能把艾滋病病毒感染降到最低，總會有病毒逃過藥物的獵殺，該療法并不能徹底清除艾滋病病毒。此外，一旦停止抗病毒藥物治療，艾滋病病毒會卷土重來，反彈到治療前水平，而反彈的艾滋病病毒將再次成為感染人體的“殺手”。因此，在這之后，研發(fā)艾滋病疫苗又成了何大一的下一個重點工作。此外，各國在防治艾滋病方面都傾注了巨大的人力和物力，雖然取得了可喜的進展，但全球仍有很多人感染艾滋病病毒。世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計：2017年有180萬人新感染艾滋病病毒，近100萬人死于艾滋??；2018年有超過3 700萬人感染艾滋病病毒。由此可見，攻克艾滋病的道路任重而道遠(yuǎn)。

黑暗中尋找生機但步履維艱

2008年，一名艾滋病患者體內(nèi)病毒消失的奇跡給予人們新的希望?；加屑毙怨撬栊园籽〉摹鞍亓植∪恕痹诮邮芄撬韫w移植手術(shù)后，其體內(nèi)病毒完全消失，成為迄今為止唯一一名被成功治愈的艾滋病患者。這一舉世矚目的成就成為近10年來國際各界人士所關(guān)注和試圖復(fù)制的焦點。研究人員再次通過干細(xì)胞和骨髓移植治療其他曾接受抗病毒藥物治療的艾滋病患者。這些患者在停止接受抗病毒藥物治療之后，體內(nèi)的艾滋病病毒載量得以被控制，但突如其來的病毒又一次澆滅了這些艾滋病患者求生的欲望。這不僅僅是對艾滋病患者身體和心理的傷害，更是對正在攻克艾滋病的研究人員的沉重打擊。

2019年3月，英國倫敦大學(xué)及劍橋大學(xué)的研究團隊在《自然》（Nature）雜志上發(fā)表了世界上第二例艾滋病患者經(jīng)干細(xì)胞移植后病情得以緩解的案例。這名艾滋病患者為了治療霍奇金淋巴瘤而接受CCR5基因純合缺失（CCR5Δ32/Δ32）的造血干細(xì)胞移植。移植后的16個月，這名艾滋病患者停止使用抗病毒藥物治療。停止用藥的18個月，這名艾滋病患者體內(nèi)的艾滋病病毒載量維持在檢測限以下。這名“倫敦病人”病情得以緩解的振奮消息再一次轟動全世界，并引發(fā)了各界關(guān)于治愈艾滋病相關(guān)話題的討論。

然而，對“倫敦病人”這一實例，該研究的主要負(fù)責(zé)人拒絕使用“治愈”一詞來形容這名艾滋病患者。一部分原因是該研究小組僅僅檢測患者血液內(nèi)的艾滋病病毒載量，未觀察及檢測其他組織。另一部分原因是研究人員對患者觀察的時間尚短，目前僅有的數(shù)據(jù)不足以用“治愈”一詞。倘若2年以后，在這名艾滋病患者體內(nèi)未見到艾滋病病毒的反彈，他將有可能接近“治愈”的邊緣并有望復(fù)制“柏林病人”成功治愈的奇跡。

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為艾滋病的基因治療提供了有力的手段。研究人員通過基因編輯技術(shù)對艾滋病病毒感染輔助受體CCR5進行體外編輯，并移植到患者體內(nèi)成為抵抗艾滋病病毒感染的替代性療法。

“柏林病人”和“倫敦病人”都是通過移植CCR5基因缺失的供體來攻克艾滋病的典型范例。但是，CCR5基因天然缺失的個體在自然界中存在的概率非常低。據(jù)統(tǒng)計，在西歐國家，僅有1%的高加索人群中有CCR5純合缺失的基因，在亞洲人群中更是極為罕見。因此，尋找CCR5純合缺失的供體可謂是難上加難。此外，在“倫敦病人”的抗病毒研究中，研究人員也提到了另一例通過CCR5Δ32/Δ32干細(xì)胞移植的艾滋病患者病例：該名艾滋病患者在暫停抗病毒藥物治療1星期后，進行了造血干細(xì)胞移植。研究人員發(fā)現(xiàn)，在移植后的3星期內(nèi)，這名艾滋病患者體內(nèi)的艾滋病病毒就開始反彈。研究人員推測，這可能是患者體內(nèi)的艾滋病病毒發(fā)生了變異，以其他途徑繼續(xù)感染人體細(xì)胞。對“倫敦病人”來說，是否能夠逃離上述難題，我們未知，這些尚需研究人員的持續(xù)監(jiān)測。

夾縫中求生存，艾滋病的基因治療迎突破

基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為艾滋病的基因治療提供了有力的手段。研究人員通過基因編輯技術(shù)對艾滋病病毒感染輔助受體CCR5進行體外編輯，并移植到患者體內(nèi)成為抵抗艾滋病病毒感染的替代性療法。

2014年3月6日，來自美國賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）上發(fā)表了首次通過基因編輯技術(shù)改造艾滋病患者自身T細(xì)胞來抵抗艾滋病病毒感染的臨床試驗報道。該項研究是在使用基因編輯技術(shù)治療艾滋病的道路上邁出的第一步，也是至關(guān)重要的一步。研究人員通過鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)對12名艾滋病患者自身T細(xì)胞中的CCR5基因進行編輯，并將改造后的T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)（每名患者回輸100億個T細(xì)胞）。隨后，這12名艾滋病患者被分為2組，每組6人。一組一直服用抗病毒藥物。另一組在服用抗病毒藥物4星期后，停止用藥達(dá)12星期。結(jié)果表明，在停止用藥的6名艾滋病患者中，有4名艾滋病患者體內(nèi)的艾滋病病毒數(shù)量顯著減少，還有1名艾滋病患者體內(nèi)的艾滋病病毒檢測結(jié)果呈陰性。研究人員發(fā)現(xiàn)，這是由于該名艾滋病患者體內(nèi)的CCR5基因存在天然突變。

該項研究提示，自體移植CCR5突變的T細(xì)胞能夠在中斷抗病毒藥物治療期間降低艾滋病患者體內(nèi)的病毒載量，抵抗艾滋病病毒的感染。這使得人們更加相信，改造T細(xì)胞有望使艾滋病患者免于使用抗病毒藥物治療，邁向“功能性治愈”艾滋病的邊緣。此外，研究人員更希望，基因編輯技術(shù)可以在人的造血干細(xì)胞中改造CCR5基因，這樣就可以獲得更多種類型、更長存留時間的免疫細(xì)胞，讓艾滋病患者自身可以提供更多的、更持久的抗病毒細(xì)胞。為此，在艾滋病的基因治療領(lǐng)域，實現(xiàn)對人的造血干細(xì)胞的基因改造顯得尤為必要。

2017年8月，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁及其合作團隊利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，在人的造血干細(xì)胞中編輯CCR5基因，其效率為27%。小鼠模型實驗顯示，經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改造的人的造血干細(xì)胞能夠在小鼠模型中重建人的免疫系統(tǒng)，抵抗艾滋病病毒的感染。為了能夠更進一步證實CCR5基因突變的造血干細(xì)胞可以在人體內(nèi)抵抗艾滋病病毒的感染，2019年9月11日，鄧宏魁再次攜手合作團隊在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）上報道了首例利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在人的造血干細(xì)胞中編輯CCR5基因，并成功將其移植到罹患艾滋病和急性淋巴細(xì)胞白血病的患者體內(nèi)。

●安全性檢測

研究人員利用前期優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對供體造血干細(xì)胞中的CCR5基因進行編輯，其效率為17.8%。為了最大限度地提高造血干細(xì)胞移植治療白血病的效率，研究人員將基因編輯的造血干細(xì)胞與原始的造血干細(xì)胞進行了混合移植。患者在接受造血干細(xì)胞的移植之后，出現(xiàn)了常見的移植并發(fā)癥。經(jīng)過常規(guī)治療后，這名患者的移植并發(fā)癥得到了緩解。隨后，中性粒細(xì)胞和血小板在移植后的第13天和27天分別出現(xiàn)重建；淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞亞群增加，CD4細(xì)胞在6個月時恢復(fù)到正常范圍并保持穩(wěn)定。在移植后的19個月隨訪中，患者的急性淋巴白血病病情得到完全緩解，實現(xiàn)了完全的供體嵌合。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯的造血干細(xì)胞可以在患者體內(nèi)存活19個月，且在這19個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對基因組造成的非特異性切割及相關(guān)的副作用。

●有效性檢測

為了探索該方法治療艾滋病的有效性，研究人員在得到倫理委員會的批準(zhǔn)及患者知情同意的前提下，暫時中斷對患者的抗病毒藥物治療。停止用藥4星期之后，患者外周血內(nèi)的艾滋病病毒載量增加到每毫升3×107個拷貝。外周血內(nèi)的CD4+T細(xì)胞數(shù)量逐級減少，CD4/CD8比例隨之降低。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改造的CD4+T細(xì)胞在總體T細(xì)胞的比例從2.96%增加到4.39%，提示該細(xì)胞具有一定的生存優(yōu)勢及對艾滋病病毒的抵抗能力。然而，該項研究中獲得的基因編輯造血干細(xì)胞占整體干細(xì)胞的比例為5%～8%，這勢必會影響其抵抗艾滋病病毒感染的能力。為此，鄧宏魁表示，無論是基因?qū)氩呗赃€是基因編輯效率，都是未來需要調(diào)整和努力的方向。此外，他表示，未來可以考慮僅僅移植經(jīng)過基因編輯的造血干細(xì)胞，從而提高基因編輯的造血干細(xì)胞在患者體內(nèi)的比例。

總之，該項研究是在使用基因編輯技術(shù)治療艾滋病的道路上邁出的第二步，對整個疾病治療領(lǐng)域來說都是一個振奮人心的消息。它不僅告訴人們，造血干細(xì)胞經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)改造后，可以在患者體內(nèi)持續(xù)存活且沒有負(fù)面影響，還為人們利用造血干細(xì)胞移植技術(shù)治療艾滋病提供了寶貴的信息和經(jīng)驗。此外，該項研究與之前出現(xiàn)的有?？蒲袀惱淼摹盎蚓庉媼雰菏录蓖耆煌窃趪?yán)格遵守倫理規(guī)范并取得受試對象的知情同意下才開展的，是以體細(xì)胞為靶標(biāo)展開的基因治療，在學(xué)術(shù)界是被認(rèn)可的。雖然這項研究在艾滋病治療方面并未取得全面的勝利，但是隨著人們對造血干細(xì)胞認(rèn)識的不斷加深，以及對基因編輯技術(shù)導(dǎo)入系統(tǒng)的不斷完善，會給諸如艾滋病一類的血液疾病和免疫系統(tǒng)的疾病治療帶來新的推動和深遠(yuǎn)的意義。