哮喘患者血漿ADMA與MTP、ATP、SDH及細(xì)胞色素氧化酶活性的相關(guān)性*

李茂林， 蔣秀園， 顧茜娜

(宜興市腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 江蘇 宜興 214200)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)屬于一種異質(zhì)性的疾病，其病理特征是慢性氣道炎癥。炎性介質(zhì)會導(dǎo)致炎性細(xì)胞聚集以及活化，臨床表現(xiàn)為不同程度的氣道高反應(yīng)性、氣道阻塞、過量的黏液分泌以及免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平升高[1-2]，哮喘的發(fā)病率以及病死率逐漸上升[3-5]。哮喘患者無論是急性發(fā)作期還是緩解期，都會出現(xiàn)機(jī)體活性氧增加以及氧化或抗氧化失去平衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)會對哮喘的發(fā)生發(fā)展起到直接的促進(jìn)效果[7-9]。線粒體功能障礙會誘發(fā)活性氧增加、引發(fā)哮喘發(fā)病或加重[10- 11]；二甲基精氨酸(dimethylarginine，ADMA)是一種內(nèi)源性的一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)抑制劑，可以與左旋-精氨酸(L-Arg)及NOS結(jié)合，從而使一氧化氮(nitric oxide，NO)生成量變少[12]，從而干預(yù)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。本研究分析哮喘急性發(fā)作患者血漿ADMA水平與線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane potential，MTP)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphoric acid，ATP)、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)及細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)活性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年2月哮喘急性發(fā)作患者30例作為哮喘組，男17例、女13例，平均(31.52±3.09)歲；其中12例為病情輕度組、18例為病情中度組，病程1周～40年；8例有激素應(yīng)用史。另選取正常體檢人群30例作為對照組，男19例、女11例，平均(31.99±3.23)歲。哮喘急性發(fā)作患者入選標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會發(fā)布的《支氣管哮喘防治指南》中的支氣管哮喘急性發(fā)作期診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。哮喘急性發(fā)作患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)支氣管哮喘緩解期患者，(2)支氣管哮喘病情嚴(yán)重度Ⅳ級患者，(3)上呼吸道以及氣管、支氣管內(nèi)腫瘤，心源性哮喘或其他能夠?qū)е孪钠髻|(zhì)性疾病患者，(4)已經(jīng)進(jìn)行其他有關(guān)治療，可能對本研究的效應(yīng)指標(biāo)觀測造成影響的患者，(5)合并有心、肝、腎以及造血系統(tǒng)等危及生命的原發(fā)性疾病及精神病患者，(6)不能配合系統(tǒng)治療、對療效無法判斷 或者資料不全對療效和安全性造成影響的患者。

1.2 方法

1.2.1分組 哮喘急性發(fā)作患者30例為哮喘組，同期正常體檢者30例為對照組，兩組患者性別、年齡和體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。見表1。

表1 兩組受試者一般資料比較(n=30)Tab.1 Comparison of general data in the two groups of patients

1.2.2血漿ADMA水平 兩組患者入院后次日晨起空腹采集外周血50 mL。將l mL血漿添加5-磺基楊酸沉淀蛋白，離心后取出10 μL血漿樣本添加100 μL/min為流速，通過柱處理后采取MS-2010 高效液相質(zhì)譜儀測定ADMA含量。

1.2.3血小板線粒體ATP水平 兩組患者入院后次日晨起空腹采集外周血50 mL。將5 mL血漿在4 ℃ 的條件下進(jìn)行12 000 r/min離心5～10 min，取中間層，在避光條件下取閃爍杯將其標(biāo)記成標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，并添加100 μL熒光素酶ATP檢測工作液，使用裂解液將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度，將其快速混勻，間隔至少2 s后，采用液閃儀和酶標(biāo)儀檢測各標(biāo)準(zhǔn)管單位時(shí)間轉(zhuǎn)化底物數(shù)(CPM)和相對光單位(relative light unit，RLU)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用考馬斯亮蘭試劑盒檢測蛋白含量。

1.2.4血小板MTP 取0.1 μmol/L羅丹明123添加反應(yīng)介質(zhì)，反應(yīng)介質(zhì)包含7 mmol/L MgCl2、150 nmol/L蔗糖、30 mmol/L KOH-HE PES、5 mmol/L K2HP04，pH為7.0～8.0，在37 ℃條件下用熒光分光光度計(jì)測定血小板線粒體熒光值。

1.2.5血小板線粒體COX 取10 μL的線粒體懸液，添加到具有亞鐵細(xì)胞色素C的反應(yīng)底物中，在550 nm處測定亞鐵細(xì)胞色素C吸光度值。

1.2.6線粒體SDH的活性 將100 μL線粒體懸液放置到清洗完畢的比色皿，添加反應(yīng)底物以及輔助因子等試劑，5 s時(shí)在600 nm處測定吸光度OD1值，1 min后對吸光度OD2值進(jìn)行測定，計(jì)算線粒體懸液中琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性。

1.2.7NO含量測定 抽取血漿5 mL，在在3 000 r/min離心10 min，測定管取血漿的上清0.5 mL，標(biāo)準(zhǔn)管取10 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.1 mL與雙蒸水0.4 mL進(jìn)行混合，充分旋渦混勻30 s，在室溫的條件下靜置40 min后，3 500～5 000 r/min離心10 min， 抽取上清0.8 mL添加顯色劑0.6 mL，進(jìn)行混合搖勻，在室溫條件下靜置10 min，使用蒸餾水進(jìn)行調(diào)零，采取分光光度計(jì)在550 nm處對每管的光密度值進(jìn)行測定。

1.2.8NOS活性測定 測定管放置10%的血漿5 mL，空白管放置雙蒸水50 μL，每管添加底物200 μL緩沖液、10 μ L促進(jìn)劑及100 μL顯色劑，混合均勻后放置在37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，取出后添加100 μL透明劑和2 mL終止液， 混合均勻后，采用分光光度計(jì)在530 nm處測定光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿ADMA濃度

哮喘組患者血漿ADMA濃度為(1.53±0.61)mmol/L，較對照組(3.27±0.95)mmol/L降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 線粒體功能

哮喘組患者線粒體MTP、ATP、COX及SDH變化與對照組比較均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 哮喘組患者與對照組線粒體MTP、ATP、COX及Tab.2 MTP, ATP, COX and SDH of asthma group and control group

2.3 NOS活性、NO含量

哮喘組患者NOS活性、NO含量變化與對照組比較，NO生成明顯減少，NOS活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表3。

表3 哮喘組患者與對照組血漿NOS活性、NO含量變化Tab.3 Plasma NOS activity and NO levels of asthma group and control group

2.4 相關(guān)性

對哮喘組患者血漿ADMA濃度與線粒體SDH、 COX、MTP及ATP含量進(jìn)行線性相關(guān)分析表明，哮喘組血漿ADMA濃度與反映線粒體功能的4個(gè)指標(biāo)(SDH、 COX、MTP、ATP)均呈負(fù)相關(guān)，ADMA與線粒體SDH的r=-0.61、P=0.001，ADMA與線粒體COX的r=-0.69、P=0.000，ADMA與線粒體MTP的r=-0.65、P=0.000，ADMA與線粒體 ATP含量的r=-0.41、P=0.039；皮爾遜相關(guān)系數(shù)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

支氣管哮喘屬于一類氣道結(jié)構(gòu)上發(fā)生的病變，而不僅僅是氣道功能出現(xiàn)的紊亂，類氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生的紊亂。哮喘的發(fā)病機(jī)制為支氣管平滑肌痙攣，不同嚴(yán)重程度或者不同病期的哮喘患者多有氣道炎癥的存在[13-14]。哮喘慢性氣道炎癥學(xué)說的成立給支氣管哮喘的治療造成了完全的改變，從對解痊平喘進(jìn)行控制從而轉(zhuǎn)變?yōu)閷獾姥装Y進(jìn)行控制的抗炎治療[15]。哮喘急性發(fā)作的主要特征是喘息、氣急、咳嗽以及胸悶等，其主要特征是患者的呼吸發(fā)生困難，呼氣流量突然變?nèi)?，該癥狀主要因?yàn)殚L期接觸變應(yīng)原等刺激物或者治療手段不合適等所引發(fā)[16]。哮喘患者無論是急性發(fā)作期或者是緩解期都具有機(jī)體活性氧變多以及氧化/抗氧化失去平衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)對哮喘的發(fā)生發(fā)展具有明顯的促進(jìn)效果。細(xì)胞代謝和免疫功能在疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。不對稱ADMA屬于內(nèi)源性的NOS抑制劑，其可與NOS結(jié)合，從而降低NO的生成[18]。本研究對哮喘急性發(fā)作患者與對照組不對稱ADMA濃度變化進(jìn)行比較，哮喘急性發(fā)作患者血漿ADMA濃度明顯降低。本研究推測不對稱ADMA可引發(fā)過氧亞硝基陰離子明顯變多，進(jìn)而引發(fā)線粒體功能出現(xiàn)障礙，進(jìn)而產(chǎn)生的過量的活性氧進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而對哮喘發(fā)病造成影響。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中，線粒體功能出現(xiàn)障礙發(fā)揮關(guān)鍵作用，在哮喘患者的氣道中線粒體功能多出現(xiàn)障礙，且其與小鼠變多的過敏性氣道炎癥具有相關(guān)性[19]。哮喘大鼠的氣道上皮細(xì)胞凋亡上調(diào)，氣道上皮細(xì)胞基質(zhì)膠原沉積變多，線粒體的數(shù)量增多，但線粒體的結(jié)構(gòu)紊亂，多形成板層體和線粒體空泡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘急性發(fā)作病人氣道粘膜的線粒體SDH和細(xì)胞色素C氧化酶的活性變?nèi)?；而且線粒體MTP變低，ATP生成明顯減少。該結(jié)果說明哮喘急性發(fā)作病人線粒體功能出現(xiàn)障礙。此外，相關(guān)性分析表明不對稱ADMA濃度與線粒體SDH、 細(xì)胞色素C氧化酶、線粒體MTP以及ATP含量均呈負(fù)相關(guān)。外源性NOS抑制劑L-NAME能夠?qū)е麓笫蟾渭?xì)胞線粒體MTP下降，而NO供體SNAP則能夠緩解大鼠肝細(xì)胞線粒體MTP的變?nèi)?。這說明內(nèi)源性ADMA的提升與哮喘急性發(fā)作病人線粒體功能障礙可能具有直接關(guān)系。不對稱ADMA能夠提升氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。不對稱ADMA還能夠?qū)OS產(chǎn)生抑制從而發(fā)生氧化應(yīng)激，不對稱ADMA能夠使NOS解偶聯(lián)。其使NO的合成前體L-精氨酸與NOS之間電子傳遞脫偶聯(lián)，使O2變成唯一的受電子體，從而導(dǎo)致超氧陰離子產(chǎn)生變多，氧化應(yīng)激明顯變強(qiáng)。此外，其降低NO的合成[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道粘膜NOS活性以及NO含量都出現(xiàn)明顯降低，說明ADMA導(dǎo)致細(xì)胞中 NOS解偶聯(lián)，NO合成變少，細(xì)胞內(nèi)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)消耗變少。

綜上所述，哮喘急性發(fā)作病人線粒體功能障礙與血漿內(nèi)源性ADMA濃度升高密切相關(guān)。ADMA導(dǎo)致線粒體功能障礙可能與減少NO生成，增加氧化應(yīng)激，抑制線粒體生物合成有關(guān)。