蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)下人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和基底細(xì)胞癌細(xì)胞中差異蛋白質(zhì)分析

王成良

皮膚鱗狀細(xì)胞癌還稱為表皮樣癌或者棘細(xì)胞癌，來自于附屬器的角朊或表皮細(xì)胞的惡性皮膚腫瘤，癌細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度角化情況。鱗狀的細(xì)胞癌一般發(fā)生在足、手背部，頭皮和頸部、面部等容易曝光的位置[1-2]。發(fā)病的因素和遺傳、紫外線照射、種族、熱輻射或者放射線損壞、瘢痕的增殖、化學(xué)的致癌物等有關(guān)聯(lián)。鱗狀的細(xì)胞癌到后期還容易轉(zhuǎn)移，體內(nèi)主要器官的轉(zhuǎn)移、局部的淋巴轉(zhuǎn)移、全身骨骼的轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移，有的甚至?xí){到生命安全。皮膚基底的細(xì)胞癌為來自于皮膚附屬器或者表皮內(nèi)多潛能基底樣的細(xì)胞分化中較好的惡性皮膚腫瘤，一般多發(fā)于鼻溝旁、面部和頰部等位置[3]。發(fā)病因素和紫外線照射與日曬有很大關(guān)系，與增生性瘢痕、大劑量X射線照射和燒傷等也有一定的聯(lián)系。皮膚基底細(xì)胞癌一般生長比較緩慢，主要表征是局部皮膚發(fā)生損壞，轉(zhuǎn)移情況極少。

1 材料與方法

1.1 材料來源

皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)-431(購自美國菌種保藏中心)，皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞系TE354.T(購自美國菌種保藏中心)。

1.2 主要設(shè)備與試劑

主要試劑：胎牛血清白蛋白(由美國Sigma公司生產(chǎn))，DMEM高糖培養(yǎng)基(由美國gibco公司生產(chǎn))，雙抗(由北京Solarbio公司生產(chǎn))，胎牛血清(由美國Sigma公司生產(chǎn))，二硫蘇糖醇(由北京Solarbio公司生產(chǎn))，胰蛋白酶(由北京Solarbio公司生產(chǎn))，IPG預(yù)制干膠條(由美國GE公司生產(chǎn))，碘乙酰胺(由美國GE公司生產(chǎn))，丙烯酰胺(由美國Sigma公司生產(chǎn))。

主要設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)瓶(由美國corning公司生產(chǎn))，TGL-16G臺式高速離心機(jī)(由美國Backman coulter公司生產(chǎn))，VL-4S型超凈工作臺(由珠海再鑫儀器公司生產(chǎn))，DTX880自動酶標(biāo)儀(由美國Backman coulter公司生產(chǎn))，DYCZ-24D雙垂直電泳槽(由美國GE公司生產(chǎn))，Imagescanner掃描儀(由美國GE公司生產(chǎn))，SE 600 Ruby蛋白雙向電泳槽(由美國GE公司生產(chǎn))。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)細(xì)胞[4]基底的細(xì)胞系(TE354.T)與鱗狀細(xì)胞系(A-431)都使用細(xì)胞培養(yǎng)液(2%雙抗，87%DMEM高糖培養(yǎng)基，11%胎牛血清)，在6% CO2溫度為38 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞生長速度制作生長曲線。

1.3.2 提取樣品蛋白[5]2種細(xì)胞選取對數(shù)生長期，等到細(xì)胞生長到培養(yǎng)瓶面面積91%時候，提取樣品蛋白。使用Bradford方法檢測樣品蛋白蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 IPG預(yù)制干膠條重水化[6]雙向凝膠電泳的操作步驟依據(jù)實驗儀器說明書來進(jìn)行：將A-431和TE354.T細(xì)胞提取蛋白質(zhì)溶液和預(yù)先配置水化上樣緩沖液從冰箱中取出，室溫靜置融化；將含有100 g蛋白細(xì)胞提取蛋白質(zhì)容易加入到含有水化上樣緩沖液EP管中搖勻；把固相化pH梯度(immobilized pH gradients，IPG)預(yù)制干膠條(pH3至11，11 cm)從冰箱中取出，室溫靜置15 min；將水化緩沖液均勻平鋪在槽內(nèi)，IPG預(yù)制干膠條面向下，緩慢放置在盤槽中；1 h后將2 ml礦物油加入水槽中，使IPG預(yù)制干膠條完全覆蓋。

進(jìn)行等電聚焦電泳，并制作11%聚丙烯酰胺凝膠，而后平衡IPG膠條，隨后進(jìn)行第二向垂直板SDS-PAGE電泳，使用考馬斯亮蘭染色法[7]對交替進(jìn)行染色。

1.4 凝膠圖像掃面并分析圖像

使用UMAX PowerLook 1100掃描儀對聚丙烯酰胺凝膠掃面，使用Image Master 2D Platinum 10.0圖像分析系統(tǒng)[8]對圖像分析，包含等電點(diǎn)校正、蛋白質(zhì)點(diǎn)位置、蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量、蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量和蛋白質(zhì)點(diǎn)編輯及匹配等。最后得到這兩種細(xì)胞系中蛋白質(zhì)對應(yīng)雙向凝膠電泳的圖譜，對圖譜比較分析，把蛋白質(zhì)點(diǎn)的差異找出，得出差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)對應(yīng)等電點(diǎn)和分子量等相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 蛋白濃度的檢測情況

595 nm的波長內(nèi)牛血清蛋白的吸光度測量情況，見表1。

表1 A595與牛血清的蛋白曲線

依據(jù)表1的曲線數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)的曲線，曲線的方程是：Y=1041.753X+0.603。鱗狀細(xì)胞系(A-431)的蛋白液在595 nm波長內(nèi)吸光度為1.104，帶入方程計算得出蛋白質(zhì)的濃度是1150.7 μg/ml；基底細(xì)胞系(TE.354.T)在595 nm波長內(nèi)吸光度為0.898，帶入方程計算得出蛋白質(zhì)的濃度是936.1 μg/ml。見圖1。

圖1 牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 2種細(xì)胞系雙向的電泳情況

這兩個細(xì)胞系雙向電泳圖譜中的大眼管一樣，分子量一般在16 kDa至149 kDa內(nèi)，蛋白質(zhì)的著色點(diǎn)集合于等電點(diǎn)pH 3～8內(nèi)。

鱗狀的細(xì)胞系(A-431)中共有(112±11)個蛋白質(zhì)點(diǎn)，對應(yīng)等電點(diǎn)分布范圍是pH 3～7，分子量分布范圍是12～21 kDa和26～163 kDa內(nèi)。基底細(xì)胞系(TE354.T)中共有(94±8)個蛋白質(zhì)點(diǎn)，對應(yīng)等電點(diǎn)分布范圍是pH 3～7，分子量分布范圍是14～139 kDa。

對2種細(xì)胞系蛋白雙向凝膠電泳的圖譜對比分析，在2組凝膠內(nèi)共有19個蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)表達(dá)，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中在鱗狀的癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)下降的有2個蛋白，在鱗狀的癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上升的有13個蛋白，基底的癌細(xì)胞內(nèi)沒有檢測出的有4個蛋白。

3 討論

基底細(xì)胞癌與鱗狀細(xì)胞癌都是臨床上較為常見的惡性皮膚腫瘤，且發(fā)病于皮膚的附屬器或者表皮，病情發(fā)生和進(jìn)展都與瘢痕增生、紫外線的照射和化學(xué)的致癌物等有關(guān)聯(lián)，同時2種疾病臨床局部表征也有類似的地方[9]，但這兩種疾病在轉(zhuǎn)移上卻存在很大的差異。由于體內(nèi)細(xì)胞原來存活和生長環(huán)境發(fā)生了改變引起了腫瘤發(fā)生，并受遺傳、物理、生物和化學(xué)等原因影響，一些基因表達(dá)出現(xiàn)了變化，異常的分化發(fā)生在正常組織或細(xì)胞內(nèi)，接著異常的組織過度的出現(xiàn)導(dǎo)致異常的增殖[10-13]。調(diào)控因素對體內(nèi)的基因產(chǎn)生影響后，腫瘤產(chǎn)生的大部分過程中都有蛋白質(zhì)的參與，而且蛋白質(zhì)對腫瘤的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲都起著非常重要的作用。通過對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，那么對腫瘤前期的診療、降低治療的毒副作用和特異性治療等方面產(chǎn)生積極作用。但在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中有許多不同的蛋白質(zhì)參與進(jìn)來，腫瘤不同的時期，產(chǎn)生作用的蛋白質(zhì)種類也不盡相同，且不同的蛋白質(zhì)間也會產(chǎn)生相互影響。

目前對于基底的細(xì)胞癌與鱗狀的細(xì)胞癌發(fā)病、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和對血管形成等多種蛋白質(zhì)調(diào)查都有了深入研究，且對于人們感興趣蛋白質(zhì)在這兩種腫瘤內(nèi)還進(jìn)行了差異對比，對正常的皮膚組織、脂溢性的角化病和增生性的瘢痕等有了對比[14-15]。但在細(xì)胞內(nèi)每種蛋白質(zhì)表達(dá)的情況和蛋白質(zhì)之間的互相影響方面缺少相關(guān)的調(diào)查。本文研究發(fā)現(xiàn)，有19個有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)存在于這兩種細(xì)胞的蛋白質(zhì)內(nèi)。蛋白質(zhì)是遺傳編碼執(zhí)行者，人類生命發(fā)生和進(jìn)展都取決于組織或者細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)數(shù)量與種類。在前期發(fā)生腫瘤或出現(xiàn)一些向腫瘤進(jìn)行分化異性細(xì)胞的時候，蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)就有了改變，接下來在腫瘤不斷進(jìn)展中，腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)移、侵襲和浸潤等都是蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了改變所引起的?；椎募?xì)胞癌與鱗狀的細(xì)胞癌在腫瘤的轉(zhuǎn)移方面有很大的差異，那么蛋白質(zhì)在這兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)也會出現(xiàn)不同。本文把這兩種癌癥細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過雙線凝膠電泳進(jìn)行分離以后，得到的圖譜中有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)就是腫瘤內(nèi)表達(dá)不同的蛋白質(zhì)。

綜上所述，基底細(xì)胞系與鱗狀細(xì)胞系內(nèi)提取的蛋白樣品進(jìn)行的雙向電泳圖譜內(nèi)有差異存在，這些差異的蛋白質(zhì)是影響這兩種腫瘤在轉(zhuǎn)移方面存在差異的主要因素。