磷酸腺苷激活的蛋白激酶參與調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2活化發(fā)揮對血管平滑肌細胞胰島素樣生長因子-1信號的抑制作用

寧鈞宇 敬海明 杜宏舉 齊麗娟 高 珊 李國君,3

(1.北京市疾病預防控制中心 北京市預防醫(yī)學研究中心衛(wèi)生毒理所，北京 100013； 2.北京市食物中毒診斷溯源技術重點實驗室, 北京 100013； 3.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，北京 100069)

胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一種小分子多肽類生長因子，能夠特異性結合細胞膜表面IGF-1受體，誘發(fā)酪氨酸位點磷酸化從而導致受體激活，并進一步活化下游信號如磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等通路，刺激多種正常和腫瘤細胞的生長、增生[1]。IGF-1信號通路的活性，在涉及血管平滑肌細胞增生的動脈粥樣硬化及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是維護細胞內(nèi)能量代謝平衡的關鍵 “傳感器”及“效應器”：AMPK對細胞內(nèi)AMP/ATP比例變化高度敏感，AMP/ATP比例升高導致AMPK活化，表現(xiàn)為α亞單位172位蘇氨酸殘基的磷酸化?；罨腁MPK具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過磷酸化特異性蛋白底物，將信號向下游傳遞，抑制合成代謝等耗能過程，促進分解代謝等產(chǎn)能過程[2-3]，從而使細胞內(nèi)維持必要的ATP濃度滿足生理需要。另外，AMPK參與包括IGF-1在內(nèi)多種生長因子信號通路的調(diào)節(jié)，通過直接磷酸化結節(jié)性硬化蛋白2(tuberous sclerosis 2，TSC2)從而抑制生長因子激活的雷帕霉素靶蛋白1 (mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)信號通路[4]。因此，AMPK被認為是溝通能量代謝和生長信號的關鍵性分子，能夠對生長因子受體活化信號與細胞內(nèi)營養(yǎng)狀態(tài)起協(xié)調(diào)作用。

筆者曾經(jīng)報道AMPK通過磷酸化胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1) 794位絲氨酸和TSC2 1 345位絲氨酸抑制IGF-1信號轉導，從而抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌細胞增生及蛋白質(zhì)合成，抑制AMPK活性導致IGF-1信號通路活化增強[5]。這里，筆者進一步發(fā)現(xiàn)，AMPK還能夠通過抑制細胞內(nèi)重要的增生信號分子細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2)的活化來抑制血管平滑肌細胞IGF-1信號通路。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

二甲雙胍購自美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)試劑、轉染試劑和抗生素購自美國Invitrogen公司；IGF-1購自天漠公司；抗體購自美國Cell Signaling 公司；化學發(fā)光試劑購自美國Thermal公司。

1.2 慢病毒載體構建

Lac Z病毒表達載體和兩種帶有HA標簽蛋白的組成性激活型AMPK構建引物序列及病毒表達載體構建方法見參考文獻[5]，所構建的兩種組成性激活型AMPK分別為AMPK α亞單位氨基端312個氨基酸殘基構成的截斷體以及將該截斷體第172位蘇氨酸殘基置換為門冬氨酸殘基。敲低AMPK寡核苷酸序列及病毒載體構建方法見參考文獻[5]。

1.3 慢病毒包裝及細胞感染

用脂質(zhì)體介導轉染法包裝慢病毒，詳見參考文獻[5]。

1.4 細胞培養(yǎng)及處理

血管平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)自豬主動脈，方法參見Gockerman等[6]報道。細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5 mmol/L，含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。傳5至16代的原代培養(yǎng)細胞血清饑餓20 h后，加入3 mmol/L二甲雙胍處理20 h，再加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，棄培養(yǎng)基，收集細胞，提取蛋白，行免疫印跡檢測蛋白質(zhì)濃度。慢病毒感染細胞并獲得穩(wěn)定感染細胞系方法詳見參考文獻[5]，慢病毒感染細胞血清饑餓20 h后，加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，收集細胞，免疫印跡檢測蛋白質(zhì)濃度。

1.5 細胞增生實驗

各種細胞分別接種于六孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為含5 mmol/L葡萄糖、0.2%(體積分數(shù))貧血小板血漿(platelet-poor plasma)的無血清DMEM。50 ng/mL IGF-1作用48 h后，細胞計數(shù)，計算各種細胞IGF-1刺激組與未加IGF-1組細胞數(shù)的比值，重復3次，計算均值并比較[7]。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡

收集不同處理細胞的總蛋白質(zhì)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，一抗孵育，辣根過氧化物酶標記二抗孵育，化學發(fā)光法成像。詳見參考文獻[5]。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

為了觀察AMPK在IGF-1信號通路中的作用，采用AMPK激活劑二甲雙胍處理血清饑餓的血管平滑肌細胞，并檢測IGF-1刺激引起的ERK1/2活化狀態(tài)。IGF-1的作用能明顯降低血管平滑肌細胞AMPK 第172位蘇氨酸的磷酸化，提示IGF-1的作用導致AMPK的活化受到抑制；同時，ERK1/2的磷酸化明顯增高，表明IGF-1的作用導致ERK1/2信號活化。二甲雙胍預處理16～18 h明顯提高細胞內(nèi)AMPK活性，在二甲雙胍預處理條件下，IGF-1作用不能明顯抑制AMPK活化。同時，與IGF-1單獨作用相比，IGF-1與二甲雙胍聯(lián)合作用下，細胞內(nèi)ERK1/2活性明顯降低，提示AMPK活性能夠抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌細胞ERK1/2活化，詳見圖1。

圖1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.1 Effect of AMPK inhibition on IGF-1-stimulated activation of ERK1/2

Porcinevascular smooth muscle cells(pSMC) were incubated in serum-free medium for 40 h. Metformin (Met) was added for the last 20 h at the concentration of 3 mmol/L followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with anti-p-AMPK (T172), anti-AMPK, anti-p-ERK1/2(T202/Y204) and anti-ERK1/2 antibodies, respectively.p-AMPK：phospho-AMP-activated protein kinase；AMPK：AMP-activated protein kinase；p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2；IGF-1：insulin like growth factor-1.

2.2 組成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及細胞增生

為了證實AMPK能夠抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化，構建了兩種表達組成性激活型AMPK的慢病毒載體，AMPK(1～312)和AMPK(1～312)T172D,后者將前者第172位蘇氨酸定點突變?yōu)樘扉T冬氨酸(圖2A)，并分別感染血管平滑肌細胞(圖2B)，與作為對照的表達LacZ慢病毒感染細胞相比，兩種組成性激活型AMPK過表達細胞中，IGF-1刺激引起的ERK1/2活化均受到明顯抑制(圖2C)。由于ERK1/2活化是促進細胞增生的重要信號，并在IGF-1刺激引起的細胞增生中發(fā)揮關鍵作用，檢測了AMPK對IGF-1刺激引起的細胞增生的影響，結果顯示，與表達LacZ慢病毒感染細胞相比，兩種組成性激活型AMPK過表達的血管平滑肌細胞中，由IGF-1刺激引起的細胞增生均受到明顯抑制(圖2D)。提示AMPK活性能抑制由IGF-1刺激引起的血管平滑肌細胞增生，其抑制作用可能通過抑制細胞內(nèi)ERK1/2活化來達成。

2.3 敲低AMPK增強IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

為進一步證實AMPK活性能抑制細胞內(nèi)ERK1/2活化，用降低細胞內(nèi)AMPK表達的方法觀察是否能增強IGF-1刺激引起的ERK1/2活化。構建了3種敲低AMPK的慢病毒載體：Si-AMPK1、2、3，并分別感染血管平滑肌細胞，結果顯示，3種病毒感染均能明顯降低細胞內(nèi)AMPK表達水平(圖3A)。選用降低AMPK表達效率最高的Si-AMPK3病毒感染做進一步實驗，結果顯示，與空載體包裝的病毒感染相比， 降低AMPK表達能明顯增強IGF-1刺激引起的血管平滑肌細胞ERK1/2活化，這進一步證明AMPK活性能抑制ERK1/2活化(圖3B)。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，與環(huán)境因素、生活方式及人口老齡化密切相關的慢性非傳染性疾病動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐漸上升。動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中，在脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)皮損傷等多因素協(xié)同下，血管平滑肌細胞的表型轉化發(fā)揮了重要作用。血管平滑肌細胞由合成能力強、增生能力弱的分化型向合成能力弱、增生能力強的去分化型的表型轉化，并發(fā)生細胞增生和遷移是動脈粥樣硬化的特征性病變[8-9]，因此，研究血管平滑肌細胞表型轉化的分子機制，對于充分認識動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而提出有效防治措施具有重要意義。

動脈粥樣硬化中血管平滑肌細胞的病理性改變受到包括IGF-1在內(nèi)的多種生長因子的調(diào)控[1]，IGF-1刺激引起的AKT信號通路活化對于促進細胞增生、運動發(fā)揮重要作用，本課題組前期報道了AMPK通過直接磷酸化IRS-1 第794位絲氨酸引起PI3K活性抑制，進而抑制AKT活化，從而對血管平滑肌細胞中IGF-1信號通路起負性調(diào)控作用[5]。IGF-1刺激除了能引起AKT活化外，還能引起ERK1/2的活化[10]。AMPK對血管平滑肌細胞ERK1/2活性的影響以及AMPK是否能夠通過抑制ERK1/2活化發(fā)揮對血管平滑肌細胞IGF-1信號通路的負性調(diào)控作用，國內(nèi)外報道較少。本研究中，本課題組通過使用AMPK激活劑二甲雙胍處理、組成性激活型AMPK慢病毒感染及敲低AMPK慢病毒感染等方法，證明AMPK活化能夠導致血管平滑肌細胞IGF-1刺激引起的ERK1/2活性降低，并進而抑制細胞增生。

圖2 組成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及細胞增生Fig.2 Constitutively active AMPK suppresses ERK1/2 activation and cells proliferation stimulated by IGF-1

圖3 敲低AMPK增強IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.3 Knock-down of AMPK enhances ERK1/2 activation stimulated by IGF-1

A:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) were transduced with empty vector (Si-EVT) or three different AMPK short hairpin RNA templates(Si-AMPK 1,2,3). The cells were analyzed for AMPK protein expression. The cell lysates were immunoblotted with an anti-AMPK or an anti-β-actin antibody.B:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) transduced with Si-EVT or Si-AMPK was incubated in serum-free medium for 20 h followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with antibodies indicated, respectively.AMPK：AMP-activated protein kinase；IGF-1：insulin like growth factor-1；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2;p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2.

AMPK活化對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有明顯抑制作用，其機制涉及多個方面，有文獻[11]報道AMPK通過抑制氧化應激過程來抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生，抑制血管內(nèi)皮細胞AMPK活性明顯增強軟脂酸鹽誘導的氧化應激(oxidation stress)；與ApoE基因敲除小鼠相比，AMPKα2與ApoE聯(lián)合基因敲除小鼠血清三酰甘油濃度明顯增加，動脈粥樣硬化病灶面積明顯增大。進一步的研究[12]顯示，AMPKα2通過維持肌漿網(wǎng)鈣泵(sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase， SERCA)活性來保持細胞內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并認為AMPKα2通過此種機制抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生。Vasamsetti等[13]的研究提示，AMPK還能通過STAT3通路抑制單核細胞向巨噬細胞的分化，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此，AMPK對動脈粥樣硬化的抑制是多種途徑共同作用的結果[14]。本研究提示AMPK抑制生長因子信號活性，從而抑制血管平滑肌細胞的增生；另外,AMPK對生長因子信號的抑制，可作用于生長因子及其受體下游多條信號通路，為AMPK抑制動脈粥樣硬化提供新的理論依據(jù)。