微管相關(guān)蛋白1A在前列腺癌中的表達與其臨床特征的關(guān)系

王 蔚 蘇嘉明 袁東波 張 偉 陳衛(wèi)紅 孫兆林 朱建國*

(1.貴州醫(yī)科大學研究生院，貴陽 550000；2.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴陽 550000；3.遵義醫(yī)科大學研究生院，貴州遵義 563000)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)已成為危害男性健康的主要惡性腫瘤之一，在歐美發(fā)達國家及地區(qū)，其發(fā)病率已躍居至男性惡性腫瘤發(fā)病率的首位[1-2]。根據(jù)最新的10年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，PCa在大多數(shù)國家的發(fā)病率急劇上升，其中尤以亞洲、北歐和西歐地區(qū)的增長最為快速[3]。我國前列腺癌的發(fā)病率雖然較低，但其趨勢卻不容樂觀，伴隨著我國社會經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人們生活及飲食習慣的改變，人口老齡化日益加劇，PCa的發(fā)病率也在不斷上升且增長的速度更為快速，現(xiàn)已成為我國男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[4]。前列腺癌的病因尚不明確，可能與種族、遺傳、環(huán)境、食物、吸煙、肥胖、性激素等有關(guān)。其發(fā)生發(fā)展是由多種因素誘導的復雜過程，受到體內(nèi)、外各種因素的作用和影響。許多研究[5-7]證明某些基因的功能丟失或突變在前列腺癌的發(fā)病、進展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此尋找早期診斷前列腺癌、評估遠期預后的分子標志物是前列腺癌基礎研究的一個熱點方向。

MAP1A是微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)家族中重要的一員，附著于微管多聚體上，參與微管組裝并增加微管穩(wěn)定性[8]，其在細胞增生、分化、自噬、遷移和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了十分重要的角色。本研究采用免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測MAP1A基因在前列腺癌及正常前列腺組織中的表達情況，進一步通過癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(the Cancer Genome Atlas, TCGA)分析MAP1A的表達與臨床病理等參數(shù)之間的相關(guān)性，探討MAP1A在前列腺癌中的表達情況及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織芯片

采用前列腺癌患者組織芯片進行IHC，檢測MAP1A在99例前列腺癌及81例癌旁正常前列腺組織樣本中的表達差異。組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司(芯片編號：FM-S4006-1，芯片批號：HPro-Ade180PG-01)，組織芯片排列包含了99例原發(fā)前列腺癌患者的前列腺癌組織和81例癌旁正常前列腺組織。99例前列腺癌患者年齡50～90歲，平均年齡(70.71±7.98)歲。組織芯片包括了181個位點(其中1個為定位點)，均無組織芯片脫落。所有組織均經(jīng)直腸前列腺13點穿刺或臨床手術(shù)切除后經(jīng)病理證實為前列腺癌，患者在術(shù)前均沒有接受抗雄激素去勢治療及放射治療(以下簡稱放療)和化學藥物治療(以下簡稱化療)。臨床病理參數(shù)信息包括有：年齡、Gleason評分、腫瘤大小、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測等，同時本組織芯片沒有隨訪信息。

1.2 免疫組織化學染色

按照SP試劑盒的操作說明進行免疫組織化學染色，樣本使用二甲苯脫石蠟并用梯度乙醇再水化，3%(質(zhì)量分數(shù))的過氧化氫離子水用于滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，使用5%(質(zhì)量分數(shù))牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)孵育載玻片以阻斷非特異性結(jié)合，隨后分別進行與第一抗體及第二抗體的孵育；最后通過應用過氧化物酶復合物試劑和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺溶液實現(xiàn)蛋白質(zhì)可視化。最終實驗結(jié)果由兩位病理醫(yī)師根據(jù)以下判定標準獨立地進行盲評。免疫組化結(jié)果評判標準：根據(jù)陽性細胞所占的比例和細胞染色強度兩個方面分別計分[細胞質(zhì)和(或)細胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐顆粒為陽性細胞]: 無陽性細胞評0分, 陽性細胞≤25 %評1分，26%～50%評2分，51%～75 %評3分，>75 %評4分。著色強度無色評0分, 淡黃色評1分，棕黃色評2分, 棕褐色評3分。最終免疫組化評分(immunoreactive score, IRS)結(jié)果為兩者評分的相加總分，0分為陰性(-), 2～3分為弱陽性(±)，4～5分為陽性(+)，6～7分為強陽性(+ +)；其中(+) 和(+ +) 判為陽性結(jié)果。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應

該研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院研究倫理委員會批準(批準文號：2016026)。從貴州省人民醫(yī)院的組織庫收集了6例原發(fā)性PCa組織和6例正常前列腺組織的樣品。所有標本均按照道德和法律標準進行匿名處理，患者同意和簽訂患者知情同意書。上述樣本為前列腺根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)以及膀胱癌根治術(shù)時手術(shù)切下的前列腺組織，術(shù)后立即放液氮速凍，-80°保存?zhèn)溆谩１狙芯恐姓心嫉幕颊呔丛谑中g(shù)前進行化療或放療，所有冰凍樣本都經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin staining，HE)鑒定，符合要求才進一步提取RNA。使用天根RNA試劑盒(CatNo.DP419，TianGene，China)提取總RNA，并通過UV分光光度計NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)測量總RNA的濃度。 RT-qPCR用于檢查基質(zhì)mRNA在基質(zhì)組織中的表達狀態(tài)。qPCR檢測采用SYBR Green?染料法，反應條件參數(shù)為：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進行30個循環(huán)。所有測定一式三份進行，使用IQ5軟件(Bio-Rad)測定循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)值。用GAPDH表達對每個樣品中的基因表達進行標準化。使用比較Ct值評估靶基因表達的相對定量。

1.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件處理，臨床病理參數(shù)之間MAP1A的表達水平比較采用獨立樣本t檢驗；若方差不齊則采用近似t檢驗。前列腺癌及癌旁正常組織間MAP1A陽性表達率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MAP1A蛋白在前列腺癌組織中的表達

結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌及癌旁組織中均主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)染色，MAP1A在前列腺腫瘤細胞質(zhì)中的免疫組化染色強度主要為弱陽性和中度陽性，而在癌旁正常前列腺組織中免疫組化染色強度多為強陽性和中度陽性(圖1A、C)。組織芯片IRS評分結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌組織中的表達(4.08±1.58)顯著低于癌旁正常組織(4.91±1.46)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.699，P<0.001)(圖1B)。通過IRS評分進一步檢測組織芯片中MAP1A的陽性表達率，將0～3分定義為陰性表達，4～7分定義為陽性表達。結(jié)果顯示，在99例前列腺癌組織中58例呈陽性表達，陽性率為58.6%；而在81例癌旁良性組織中有67例染色呈陽性，陽性率為82.7%；兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.225，P=0.001)。

對99例前列腺癌患者MAP1A的表達水平與其臨床特征進行統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示，在不同臨床病理分期的前列腺癌組織中，MAP1A的表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(t=-2.678，P=0.003)，腫瘤的臨床病理分期越晚，則前列腺癌組織中MAP1A的表達越低；而在不同年齡(t=1.661，P=0.100)和不同Gleason評分(t=-0.925，P=0.357)的前列腺癌組織中MAP1A的表達差異無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

圖1 MAP1A蛋白在前列腺癌組織和癌旁正常組織中的表達Fig.1 Expression of MAP1A protein in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues

A：immunohistochemistry results of MAP1A in tissue microarrays；B：immunoreactive score；C：the expression of MAP1A (immunohistochemistry staining, 10×,20×)；* * *P<0.001； Red arrows show the positive staining cells；MAP1A:microtubule associated protein 1A;TMA：tissue microarrays；IRS:immunoreactive score;Cancer：the prostate cancer group；Normal：the adjacent normal tissues group.

*P<0.05；MAP1A:microtubule associated protein 1A;IRS:immunoreactive score.

2.2 MAP1A mRNA在前列腺癌及正常前列腺組織中的表達情況

應用RT-qPCR檢測前列腺癌組織(n=6)和正常前列腺組織(n=6)中MAP1A mRNA表達量。以MAP1A基因的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行擴增，引物序列為(F: 5′-GAGAGGCTTCCTCCTACACC-3′ R：5′-GTCTCCCCCAGGCTCTAAAC-3′)，結(jié)果在186bp擴增到清晰條帶，與預期的片段大小一致(圖2A)。圖2B中結(jié)果可見，MAP1A mRNA在前列腺癌中的表達量為正常前列腺組織中表達量的0.81倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019)，即MAP1A mRNA在PCa組織中表達顯著低于正常前列腺組織。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中MAP1A的表達降低與前列腺癌的侵襲性進展和預后的關(guān)系

為了進一步驗證MAP1A表達情況與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，對TCGA公共數(shù)據(jù)庫中497例前列腺癌患者MAP1A mRNA表達水平與其臨床病理特征進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，MAP1AmRNA的表達在不同臨床特征的腫瘤組織中差異具有統(tǒng)計學意義，即Gleason評分高，病理分期晚，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)MAP1A表達量更低，表明MAP1A在前列腺癌中表達水平低，則患者臨床預后較差，詳見表2。

3 討論

前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展是由眾多因素的改變引起的，許多研究[9-11]表明前列腺癌的預后與確診時前列腺癌的分期具有直接的相關(guān)性，因此早期診斷對患者的治療和預后有重大意義。前列腺癌的診斷手段包括：直腸指檢、血清前列腺特異性抗原 (prostate specific antigen，PSA) 檢測、前列腺B超和盆腔磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)檢查等方式[12]，其中血清PSA檢測在臨床上最為常用，通過評估血清PSA濃度，大多數(shù)患者在癌癥早期可通過前列腺穿刺明確診斷[13-14]。但PSA濃度可受到諸多因素的影響，如年齡、前列腺肥大、前列腺炎、導尿術(shù)和膀胱鏡檢查后、前列腺穿刺活檢或前列腺手術(shù)后等，都將導致不同程度的升高，因此缺乏前列腺癌的特異性。此外，當PSA處于4～10 ng/mL的灰度區(qū)間時，仍有25%的患者可能為前列腺癌，而PSA<4 ng/mL時也有15%患者可能是前列腺癌[15-16]。因此單純依靠PSA進行篩查可發(fā)生前列腺癌的過度診療及患者生活質(zhì)量下降的問題，故不能把穿刺活檢應用于大樣本人群的篩查和早期診斷[17-18]。目前PCa的診療方案及遠期預后主要取決于疾病的臨床病理學特征，例如腫瘤分期、血清PSA濃度、手術(shù)邊緣狀態(tài)和Gleason評分等[19-20]。前列腺癌的遠期預后及生存率有賴于早期診斷和早期治療，而PCa的臨床進展是從無痛或無臨床意義的惰性腫瘤到侵襲性、轉(zhuǎn)移性的致死性疾病。據(jù)統(tǒng)計[21]，發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移的侵襲性PCa患者的5年相對生存率為28%，而局部或區(qū)域性的惰性低風險PCa患者的存活率則接近100%。對于惰性的低風險腫瘤患者來說，采用積極監(jiān)測的保守治療方式可能比手術(shù)治療更能保證其生命質(zhì)量[22]。因此臨床上需要一種精準的腫瘤標志物來補充及提高前列腺癌的診斷率，并能有效地區(qū)分惰性和侵襲性病例，從而確定最佳的治療策略。

圖2 MAP1A在前列腺癌及正常前列腺組織中的RT-qPCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-qPCR results of MAP1A in prostate cancer and normal prostate tissue

A: The electrophoresis of PCR product for MAP1A；B: Histogram for the relative expression levels for MAP1A;*P<0.05；MAP1A:microtubule associated protein 1A;MAP1A-Normal: the normal prostate tissues group；MAP1A-Cancer: the prostate cancer group；GAPDH: internal reference.

表2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中前列腺癌患者MAP1A mRNA表達與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Associations of MAP1A mRNA expression with clinical characteristics of prostate patients

MAPs和微管蛋白是組成微管的主要成分，微管是細胞骨架的主要結(jié)構(gòu)成分之一，參與細胞的許多生理功能：維持細胞正常的形態(tài)，作為細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)耐ǖ?，參與纖毛、鞭毛的運動，還在細胞分裂、細胞周期、細胞增生、細胞自噬過程中發(fā)揮重要作用[23]。微管相關(guān)蛋白 1(MAP1)是MAPs家族中的經(jīng)典成員之一，哺乳動物基因組通常包含3個家族成員：MAP1A、MAP1B和MAP1S。MAP1A主要分布在神經(jīng)元的軸突和樹突中，可以參與微管組裝、調(diào)節(jié)微管運動及穩(wěn)定性并促進微管聚合成束，對軸突、樹突的生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[24-25]。研究[26-27]表明MAP1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如Meyer等[26]研究發(fā)現(xiàn)MAP1A可在膠質(zhì)瘤中抑制腫瘤細胞增生，從而抑制腫瘤的生長、侵襲等作用。Knutson等[27]發(fā)現(xiàn)，相對于正常乳腺組織及血液，MAP1A在乳腺癌中上調(diào)表達，其作為孕酮受體的下游靶基因，可聯(lián)合預測乳腺癌早期轉(zhuǎn)移及不良預后事件的發(fā)生，從而作為乳腺癌潛在的內(nèi)分泌治療靶點。Jiang等[28]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，MAP1S和富含亮氨酸的三角狀五肽重復結(jié)構(gòu)蛋白(leucine rich pentatricopeptide repeat containing，LRPPRC)可以協(xié)同調(diào)控前列腺細胞自噬，作為前列腺癌患者預后的標志物。本研究顯示，相比于癌旁正常前列腺組織，MAP1A蛋白在前列腺癌組織中的表達顯著下調(diào)(P<0.001)。同時組織芯片結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌旁正常組織中陽性表達率為82.7%，在癌組織中表達率為58.6%，說明其可作為提高前列腺癌診斷率的一種輔助標志物。RT-qPCR結(jié)果進一步表明，MAP1A mRNA在正常前列腺組織中的表達顯著高于前列腺癌組織，這說明MAP1A的異常表達在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要的角色。但是因本資料入組樣本有限，關(guān)于MAP1A在前列腺癌診斷中的價值及作用，還需要進行驗證。因此筆者進一步使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析MAP1A的表達與前列腺癌患者臨床病理學特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，MAP1A的表達與患者的年齡無關(guān)，但在不同Gleason評分(P<0.001)、臨床病理分期(P=0.009)、轉(zhuǎn)移(P=0.008)、總體生存率(P=0.049)的腫瘤組織中，差異具有統(tǒng)計學意義。MAP1A的表達越低，腫瘤分化越差、病理分期越晚，故惡性程度越高，同時腫瘤患者的遠期生存率也越低。因此綜上所述，筆者推測MAP1A在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要的作用。

總之，本研究拓展了臨床科研工作者對MAP1A在前列腺癌中的研究認識，MAP1A在前列腺腫瘤組織中表達顯著下調(diào)，其表達與臨床特征顯著相關(guān)。通過對術(shù)后腫瘤組織中MAP1A的檢測，可能有助于提高前列腺癌診斷的準確性并有效地區(qū)分惰性和侵襲性疾病，是對患者的預后評估及指導治療的一個重要的潛在靶點，但這還需在未來進行大樣本的臨床驗證。