一種基于18F-19F同位素交換的分子影像探針合成方法與應(yīng)用研究進(jìn)展

張重慶, 孫夕林, 吳麗娜,劉楊, 申寶忠

PET/CT作為分子影像技術(shù)之一，能夠在活體實(shí)現(xiàn)對組織、細(xì)胞及分子水平的代謝和功能狀態(tài)的顯像；這不僅能夠揭示疾病的分子事件進(jìn)行疾病的早期診斷，而且在新藥研發(fā)和個(gè)體化治療療效監(jiān)測方面有著巨大的應(yīng)用潛能。因此，高特異性、高親和力探針的開發(fā)和應(yīng)用成為分子影像學(xué)的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。

眾所周知，在PET/CT分子顯像的實(shí)踐中，最為關(guān)鍵的是基于正電子核素的放射性探針的構(gòu)建。在放化探針的研發(fā)中，因18F具有理想的半衰期(109.8 min)，易于引入化合物形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵以及高正電子豐度(β+>97%)等優(yōu)勢，成為放射性藥物的研究熱點(diǎn)[1]。

目前常規(guī)的18F標(biāo)記探針的標(biāo)記方法，主要包括親核取代、親電取代、點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)及通過輔基間接標(biāo)記等方法[2]。研發(fā)新的標(biāo)記方法，構(gòu)建出性能優(yōu)異的探針，對于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和早期篩查有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。利用放射性核素標(biāo)記生物大分子時(shí)，在相對溫和的反應(yīng)條件下得到高放化產(chǎn)率(radiochemical yeild，RCY)的藥物一直是一個(gè)難題。在這種情況下，幾種非碳元素(如硅、鋁、硼)直接結(jié)合到生物分子中作為18F放射性標(biāo)記的氟化物結(jié)合位點(diǎn)，引起了分子影像學(xué)界放化學(xué)家的極大關(guān)注，基于同位素交換(isotope exchange,IEX)的標(biāo)記方法也應(yīng)運(yùn)而生[3]。例如，Schirrmacher等[4]應(yīng)用氟硅化合物先偶聯(lián)生物分子后，利用18F-19F IEX的原理一步標(biāo)記得到放射性產(chǎn)物。2005年Ting等[5]則開發(fā)了一種利用芳香三氟硼酸鹽進(jìn)行生物分子標(biāo)記的方法，實(shí)現(xiàn)了利用氟硼化合物標(biāo)記生物分子以進(jìn)行分子靶向成像；隨后，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究，基于同位素交換的原理，開發(fā)了一類新型的兩性放射合成子(radiosynthon)，其典型代表是N-烷基胺甲基三氟硼酸鹽(ammonimethyltrifluoroborate,AMBF3)[6]，利用該合成子及其類似物，成功標(biāo)記了多種生物分子和功能片段，合成的一些探針表現(xiàn)出優(yōu)秀的在體分布性能，本文就目前該標(biāo)記方法和應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

基于同位素交換利用AMBF3標(biāo)記的方法與優(yōu)勢

1.利用放射性合成子AMBF3的標(biāo)記方法

該標(biāo)記方法主要分為三步：①放射性合成子AMBF3的合成。 AMBF3合成子可以先通過N，N-二甲基炔丙基胺與碘代甲基硼酸頻哪醇酯 (iodomethylboronyl pinacolate)發(fā)生烷基化反應(yīng)，得到的中間產(chǎn)物在與氟氫化鉀在酸性溶液和45℃的條件下反應(yīng)兩小時(shí)經(jīng)氨水淬滅得到放射性合成子AMBF3[7]。 ②生物分子與放射合成子的偶聯(lián)。其主要原理是通過該合成子一端炔基結(jié)構(gòu)與含有疊氮結(jié)構(gòu)的目標(biāo)生物分子在銅催化下的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)(copper-Catalyzed click reaction,CuAAC)合成生物偶聯(lián)綴合物。非肽類的疊氮化功能分子易從商業(yè)來源獲得，可以直接與放射合成子進(jìn)行偶聯(lián)。對肽類生物分子進(jìn)行偶聯(lián)前，則需先在肽的N端偶聯(lián)疊氮結(jié)構(gòu)。其主要步驟為：在N-甲基-2-吡咯烷酮中使用過量的溴乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(bromoaceric acide- N-Hydroxysuccinimide easter,NHS ester)在室溫下將溴乙酸NHS酯偶聯(lián)至肽序列的N端；通過將肽與過量的疊氮化鈉一起孵育，用疊氮化物置換由步驟1得到的連接肽的末端溴化物，分離純化后即可進(jìn)行與放射合成子偶聯(lián)。③18F-19F同位素交換兩步。 合成該生物分子偶聯(lián)物后，通過18F-19F IEX在pH值為2.0～2.5的條件下(鄰二氮雜苯-鹽酸緩沖液配置)，反應(yīng)20min后即可完成18F標(biāo)記,然后在氨水淬滅后，通過C18 light固相萃取柱進(jìn)行分離。短時(shí)間內(nèi)即可獲得高比活度(>3Ci/mmol)、高純度(>98%)及較高放化產(chǎn)率(RCY>20%～40%，n>20)的放射性產(chǎn)物(圖1)。

圖1 利用放射性合成子AMBF3的標(biāo)記流程

2.利用AMBF3進(jìn)行放化標(biāo)記的優(yōu)勢

由于氟元素特殊的化學(xué)性質(zhì)，常規(guī)的18F標(biāo)記多需要進(jìn)行共沸干燥，然后在有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)，且反應(yīng)條件較為苛刻。而上述標(biāo)記策略能夠?qū)崿F(xiàn)在水性條件下進(jìn)行標(biāo)記，無需干燥步驟。同時(shí)，該方法分離提純手段簡單，進(jìn)一步縮短了標(biāo)記時(shí)間，在一定程度上間接提高了合成產(chǎn)率。除此之外，該標(biāo)記策略所引入的化學(xué)基團(tuán)分子量較小，對于生物大分子或功能片段的影響較小?？偨Y(jié)該方法的主要優(yōu)勢包括：①水性條件下一步法進(jìn)行放射性標(biāo)記；②無須對18F-進(jìn)行干燥，縮短了標(biāo)記時(shí)間；③無需進(jìn)行HPLC分離純化，合成步驟簡單；④基于不同類型的生物分子進(jìn)行標(biāo)記可完成PET活體顯像，適于推廣應(yīng)用；⑤有同時(shí)標(biāo)記多個(gè)功能片段或生物分子的潛能；⑥能獲得較好的放射化學(xué)產(chǎn)率(RCY>25%)和高比活度(>3Ci/mmol)；⑦引入的標(biāo)記基團(tuán)分子量較小，對生物分子性能的影響較小[8]。

利用AMBF3標(biāo)記生物分子在腫瘤分子顯像中的應(yīng)用

1.18F-AmBF3-MJ9靶向胃泌素肽受體顯像在前列腺癌中的應(yīng)用

胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)是一種G蛋白偶聯(lián)家族受體，通過與配體結(jié)合活化而發(fā)揮作用，與多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌等的發(fā)生、增殖、血管形成和侵襲密切相關(guān)。蛙皮素(Bombesin，BBN)是從一種兩棲動(dòng)物中提取的多肽，與哺乳動(dòng)物內(nèi)源性胃泌素釋放肽(gastric-releasing peptide,GRP)有相似的保守C 端，可以與胃泌素肽受體特異性結(jié)合。因此，研究人員利用多種正電子核素如64Cu、68Ga、18F對蛙皮素及其類似物進(jìn)行標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)對胃泌素釋放肽受體這一靶點(diǎn)進(jìn)行成像，從而對早期前列腺癌的診斷提供幫助[9]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類蛙皮素拮抗劑如RM26等，經(jīng)放射性標(biāo)記后對GRPR有更高的親和性，有助于提高探針對前列腺癌腫瘤細(xì)胞的靶向[10]。因此，基于之前報(bào)道的利用放射性合成子AMBF3標(biāo)記多肽的方法，Pourghiasian等[11]標(biāo)記了一種GRPR拮抗劑18F-AmBF3-MJ9 并進(jìn)行前列腺癌荷瘤鼠的顯像。其中AmBF3-MJ9是通過銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，并通過氨基甲基-三氟硼酸鹽(AmBF3)共軛炔和含疊氮結(jié)構(gòu)的MJ9制備，與GRPR具有良好的結(jié)合親和力(Ki=0.5±0.1nM)。隨后通過簡單的一步法18F-19F同位素交換反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，在25min內(nèi)完成標(biāo)記，所得探針18F-AmBF3-MJ9基本參數(shù)為：放化產(chǎn)率(RCY)=(23±5)%(n = 3)，放化純度>99%，比活度為(100±32)GBq/mmol)。

GRPR陽性腫瘤細(xì)胞PC3荷瘤鼠離體分布實(shí)驗(yàn)證明，探針在腫瘤、胰腺、小腸有高攝取，在注射探針兩小時(shí)后攝取值(每克組織注射劑量百分比)分別為2.20±0.13、 4.75±2.36和8.67±11.5(%ID/g)。腫瘤與肌肉的攝取比值隨時(shí)間延長明顯增加，在注射探針后2h腫瘤與肌肉的攝取比值可達(dá)77±7。此外，使用GRPR拮抗劑進(jìn)行阻斷后顯像，腫瘤的攝取可以阻斷60%；同樣說明了該探針能與GRPR特異性結(jié)合。在體成像和生物分布實(shí)驗(yàn)得出一致的結(jié)果。通過該標(biāo)記方法，成功實(shí)現(xiàn)了GRPR受體靶向探針的一步法放射性標(biāo)記，獲得較高放化產(chǎn)率和放化純度的探針，其腫瘤與本底的高攝取比，也為實(shí)現(xiàn)靶向GRPR顯像提供了可能(圖2a、2b)。

2. 18F-AMBF3-TATE靶向生長抑素受體顯像在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的應(yīng)用

生長抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)是一種G蛋白偶聯(lián)家族受體，具有典型的7-跨膜結(jié)構(gòu)域。已被發(fā)現(xiàn)的五種不同的亞型中(SSTR 1～5)，SSTR2對生長抑素(SST)及其類似物親和力最高。而大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumors,NETs)具有高表達(dá)水平的SSTR，這為實(shí)現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分子顯像提供了理論基礎(chǔ)。

圖2 利用同位素交換合成探針18F-AmBF3-MJ9和18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像圖[11,15]。灰度值以ID%/g為準(zhǔn)；a～b) 注射劑量百分比范圍為0～3 ID%/g； c～d) 為0～15 ID%/g。T：腫瘤；I：小腸；K：腎臟。a) 18F-AmBF3-MJ9靶向前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； b) 100 ug of BAY86-7548阻斷后18F-AmBF3-MJ9前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； c)18F-AMBF3-TATE 靶向生長抑素受體陽性AR42J細(xì)胞荷瘤鼠成像；d) 阻斷SSTR2后，18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像。

近30年來，放化學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了許多靶向SSTR2的分子影像探針，以用于NETs的診斷、分期，甚至標(biāo)記治療性核素以完成分子靶向治療[12]。在這些針對靶向SSTR2受體的生物分子中，特別是標(biāo)記奧曲肽(Octreotate)及其衍生物(Tyr3-Octreotate,TOC、Tyr3-Thr8-Octreotate,TATE)的多種探針，已經(jīng)用于靶向神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤SSTR2的無創(chuàng)成像。如111In-pentetreotide(商品名Octreoscan,Mallinckrodt公司)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，目前已成為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[13]；而68Ga標(biāo)記奧曲肽的衍生物的探針如68Ga-DOTATOC、68Ga-DOTATATE和68Ga-DOTANOC等，同樣顯示了對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的高親和性和巨大潛能[14]。但是由于111In為單光子顯像劑，68Ga標(biāo)記的藥品尚未批準(zhǔn)用于臨床，但18F標(biāo)記奧曲肽及其衍生物仍具有重要的研究價(jià)值。

2014年，Liu等[15]利用AMBF3成功標(biāo)記了奧曲肽的衍生物得到了高親和力的探針18F-AMBF3-TATE，未經(jīng)衰減矯正的放化產(chǎn)率(RCY)為20%～25%。體外實(shí)驗(yàn)顯示18F-AMBF3-TATE針對于SSTR2受體比68Ga-DOTATATE有更好的親和力[Ki分別為(0.136±0.03) nM和(0.76±0.2) nM]；與SSTR其它亞型的親和力較低或不結(jié)合，顯示其具有較好的特異性。SSTR2陽性荷瘤鼠(AR42J)注藥后1h行PET顯像，腫瘤組織表現(xiàn)為明顯攝取(腫瘤每克組織百分注射劑量率)，均值為(10.26±2.1)%ID/g，最大值為(23.6±3.0)%ID/g，競爭抑制劑阻斷后攝取明顯減低。相反，血池和肌肉中的平均攝取分別為(0.40±0.31)%ID/g和(0.11±0.03) %ID/g。離體生物分布實(shí)驗(yàn)和成像結(jié)果一致，腫瘤攝取百分比可達(dá)(10.11±1.67)%ID/g。動(dòng)物顯像和離體實(shí)驗(yàn)都顯示該探針主要經(jīng)腎臟代謝，而且非特異性結(jié)合清除迅速，肝膽攝取低，骨吸收未見顯示，探針結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

將18F-AMBF3-TATE與現(xiàn)有的十多種標(biāo)記奧曲肽及其衍生物的探針進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)該探針的腫瘤特異性攝取值最高。尤其是與標(biāo)記相同生物分子的探針68Ga-DOTATATE相比，該探針的腫瘤特異性攝取是其5倍以上。該結(jié)果表明該合成方法對于提高多肽的親和力方面有明顯優(yōu)勢，應(yīng)用這種標(biāo)記方法可能對其他肽類示蹤劑的研發(fā)具有重大研究價(jià)值。其高親和力和靶向性，也為進(jìn)入臨床應(yīng)用研究提供了可能(圖2c、2d)。

AMBF3及其衍生物在多功能分子影像探針構(gòu)建中的應(yīng)用

在分子影像領(lǐng)域，多模態(tài)、多功能成像因其能夠提供多方面的信息而備受關(guān)注。因此，熒光/PET雙功能探針的優(yōu)勢是十分明顯的，構(gòu)建此探針可以通過在體和離體兩種途徑定量分析同一生物分子探針濃度，這不僅可以通過PET顯像為術(shù)前診斷與分期、術(shù)后療效監(jiān)測提供幫助，更為離體組織病理學(xué)或熒光引導(dǎo)手術(shù)提供了可能。該標(biāo)記策略，為成功標(biāo)記熒光/PET雙功能探針，多途徑成像的實(shí)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。

血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程起到了至關(guān)重要的作用，靶向腫瘤新生血管的診斷和治療成為研究的熱點(diǎn)[16]。整合素αVβ3作為細(xì)胞黏附因子家族的重要成員，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等功能，在腫瘤血管生成的過程中發(fā)揮重要作用[17]。1984年由Ruoslahti等[18]首先報(bào)道了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的多肽RGD，其能被整合素αVβ3的α鏈的胞外段識別，成為靶向血管生成成像的重要生物分子。

圖3 利用同位素交換合成雙模態(tài)探針的示意圖及應(yīng)用[22]。a) 熒光、核素雙標(biāo)記模式圖； b) Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate探針PET荷瘤鼠在體成像； c) 離體組織熒光成像。

整合素αVβ3在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面中均有異常高表達(dá)，正常細(xì)胞表達(dá)程度低甚至不表達(dá)?；赗GD肽或其修飾后的標(biāo)記物，在靶向αVβ3整合素的成像中廣泛應(yīng)用。隨后放化學(xué)家對RGD肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與線性RGD肽相比，環(huán)形結(jié)構(gòu)的RGD肽(Circle RGD,cRGD)更穩(wěn)定,具有更好的親和力和特異性。 而針對cRGD,研究者又進(jìn)行了二聚化、多聚化以增加親和力，增加修飾基團(tuán)以改善性能，引入雙功能螯合劑(HYNIC、DOTA、DTPA等)以適應(yīng)多種標(biāo)記策略等多方面的嘗試。

2013年，Li等[19]在基于同位素交換的原理下，利用一種放射性合成子18F芳基三氟硼酸根陰離子(18F-ArBF3-)成功標(biāo)記二聚體環(huán)形RGD，從而得到探針[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3 ，并且和幾種18F標(biāo)記方法進(jìn)行了初步比較，在放化產(chǎn)率方面，該方法與通過NOTA-bisRGD的一步18F-Al螯合合成18F-Al-NOTA-bisRGD的合成效率一致，放化產(chǎn)率(RCY)為5%～25%[20]；高于利用輔基進(jìn)行18F兩步法標(biāo)記的放化產(chǎn)率(RCY=7%～12%)[21]。[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3在體成像和離體生物分布實(shí)驗(yàn)均顯示出探針在高表達(dá)整合素αVβ3的荷瘤鼠(U87M)腫瘤組織中具有高特異性攝取(Tumer/Muscle>6;Tumer/Blood>9)，而骨的攝取值不到0.5%ID/g。

2014年，Liu等[22]利用該放射合成子標(biāo)記的經(jīng)驗(yàn)，在前述基礎(chǔ)上進(jìn)一步推進(jìn)，開發(fā)出一種熒光/PET雙功能探針Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate，這對于實(shí)現(xiàn)多模態(tài)、多手段成像以便于疾病的早期診斷有著重要意義。該探針前體的合成包括三步：首先在季戊四醇核心的一條側(cè)鏈上連接合成子AMBF3，然后在剩余三條側(cè)鏈上連接炔基結(jié)構(gòu)，最后通過點(diǎn)擊化學(xué)與三條側(cè)鏈上炔基發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)偶聯(lián)一個(gè)有機(jī)熒光劑羅丹明和兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)RGD。合成前體后，通過同位素交換的方法完成18F標(biāo)記。利用標(biāo)記的正電子核素進(jìn)行高分辨的PET顯像，顯示出該探針具有較高的特異性(2.5～5.5 %ID/g)，離體生物分布實(shí)驗(yàn)也得到了一致結(jié)果(2.9～3.8 %ID/g)。同時(shí)標(biāo)記的羅丹明熒光染料，則利用其較高的摩爾消光系數(shù)，易通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與生物分子發(fā)生共軛，同時(shí)具有生物相容性好、在體內(nèi)穩(wěn)定等優(yōu)良的光學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)特征[23]。因此，離體組織熒光現(xiàn)象也得到了較好的成像效果，腫瘤組織與肝腎對比有明顯熒光(圖3)。

此外，本標(biāo)記方法已經(jīng)在針對多種靶點(diǎn)的探針開發(fā)中進(jìn)行了廣泛而有益的探索。例如Lau等[24]利用該方法，將AMBF3與磺胺類衍生物偶聯(lián)后進(jìn)行18F標(biāo)記， 制備了對含碳的脫水酶-IX(CA-IX) 靶點(diǎn)成像的分子影像探針。Zhang等[25]利用該標(biāo)記方法，將AMBF3與三苯基磷及其衍生物偶聯(lián)，完成18F標(biāo)記后成功進(jìn)行了心肌灌注顯像。Li等[26]同樣利用該方法成功地將18F-ArBF3與綴合磷32P的寡核苷酸進(jìn)行偶聯(lián)，得到了雙標(biāo)記的寡核苷酸，拓寬了該方法的應(yīng)用范圍。

基于18F-19F同位素交換的原理，利用AMBF3及其衍生物，成功實(shí)現(xiàn)了對生物大分子及少數(shù)小分子有機(jī)物的放化標(biāo)記，同時(shí)也為多功能分子影像探針的構(gòu)建搭建了一個(gè)平臺。而且該方法標(biāo)記過程相對簡便易行，用時(shí)較短，一定程度上彌補(bǔ)了反應(yīng)效率的不足。因而基于18F-19F同位素交換并利用該合成子標(biāo)記的方法得到了廣泛的應(yīng)用。這些探針的開發(fā)，成功實(shí)現(xiàn)了針對多種靶點(diǎn)、多功能的分子成像，部分探針更是展現(xiàn)出了巨大的臨床應(yīng)用潛能?？傊S著該方法成功標(biāo)記的生物分子或功能基團(tuán)的多種探針的不斷開發(fā)和廣泛應(yīng)用，基于18F-19F同位素交換原理并利用AMBF3及其類似物進(jìn)行探針標(biāo)記的策略將在分子影像學(xué)中發(fā)揮更大的作用。