腸類器官研究與傳統(tǒng)形態(tài)學教學相結(jié)合的芻議

王鋒超，王健欣，楊杰，高美嬌，蔣吉英，粟永萍

（1 陸軍軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學系防原醫(yī)學教研室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶，400038；2 山東濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院人體解剖學教研室，濰坊，261053）

近十年生物醫(yī)學相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域迎來了跨越式的發(fā)展，其中在基因編輯、干細胞及重編程等多個領(lǐng)域較為突出。在干細胞領(lǐng)域除了誘導(dǎo)型干細胞外，類器官（organoid）技術(shù)由于其對生命科學和醫(yī)學等領(lǐng)域的巨大影響，在2013 年被Science 評選為年度十大技術(shù)突破；Nature Methods 又將其確定為2017 年的年度技術(shù)[1-3]。創(chuàng)新人才培養(yǎng)成為新時期高校的核心任務(wù)，特別是培養(yǎng)拔尖創(chuàng)新人才被列入《國家中長期教育改革和發(fā)展規(guī)劃綱要(2010-2020 年)》[4]。作為西南地區(qū)的重點醫(yī)學院校和國家重點實驗室的分室，我們承擔了陸軍軍醫(yī)大學類器官和單細胞技術(shù)平臺建設(shè)，在本科生和研究生帶教中，也嘗試了將類器官等新技術(shù)和傳統(tǒng)的形態(tài)學相關(guān)的教學進行有機的融合。作為醫(yī)學院校，讓醫(yī)學本科生參與科學研究是培養(yǎng)學生創(chuàng)新思維和科學素養(yǎng)的重要途徑，也成為不可以回避的任務(wù)[5,6]。我們教研室特別注重科研與教學活動的融合。

1 類器官研究的起源和進展

類器官一詞最早應(yīng)用在腫瘤學領(lǐng)域，例如在1946 年被用于描述皮樣囊腫。到20 世紀60 年代以后，類器官培養(yǎng)主要用于描述經(jīng)典發(fā)育生物學實驗研究中細胞分類聚集等現(xiàn)象[1-3]。但長久以來，由于技術(shù)和實驗材料等原因的限制，這些類器官并不能長時間的在體外培養(yǎng)。近年來，隨著研究者對干細胞本身特性和微環(huán)境認識的不斷深入，對生長因子特別是Wnt 通路相關(guān)的生長因子的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以及對新的細胞外基質(zhì)成分的商品化，終于在2009 年，Sato 等通過模擬干細胞微環(huán)境，在基質(zhì)膠內(nèi)成功實現(xiàn)了腸道類器官的3D 培養(yǎng)。此后，類器官獲得迅速發(fā)展，相繼在多個系統(tǒng)包括神經(jīng)、呼吸、消化、內(nèi)分泌、生殖中實現(xiàn)了成功培養(yǎng)[1-3]。

總體來講，目前對類器官定義包含以下兩個方面：①類器官的細胞來源，可以是全能性的胚胎干細胞和誘導(dǎo)的全能性干細胞，也可以是成體組織的干細胞或者前體細胞。②類器官的特性，在體外能夠自動組裝成類似于在體器官的包含多種分化功能細胞的微觀結(jié)構(gòu)，并至少能夠重現(xiàn)在體器官的部分功能。目前，類器官從細胞成分來說：主要是指上皮來源的細胞進行自我組裝，其中也可以包含間質(zhì)細胞等其他細胞成分，大部分類器官可以長期的傳代培養(yǎng)[2,3]。

2 和傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)相比類器官的優(yōu)勢

和傳統(tǒng)的2D 細胞培養(yǎng)相比，3D 類器官培養(yǎng)具有獨特的優(yōu)勢。首先是空間和形態(tài)學的優(yōu)勢。2D 細胞不能反映組織細胞的空間排布，在信號通路激活等多個方面和在體組織和器官相去甚遠。只有具有3D 結(jié)構(gòu)的類器官培養(yǎng)才能談得上對在體組織器官在形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)上進行模擬。另外2D 細胞培養(yǎng)的繁殖過程只是平面上細胞數(shù)量增加并逐漸產(chǎn)生接觸抑制，而類器官的生成過程伴隨著干細胞的增殖和分化，不同分化狀態(tài)的細胞間相互誘導(dǎo)、反饋、影響，形成了特有的細胞間通信模式，可做到同類型細胞的聚集，能再現(xiàn)體內(nèi)器官發(fā)生的多個方面[2,3]。比如腸道類器官，具有增殖能力的細胞聚集在一個區(qū)，可形成類似于在體的“隱窩樣”結(jié)構(gòu)；在隱窩結(jié)構(gòu)中與在體腸壁類似，Lgr5 干細胞和Paneth 細胞比鄰；而相對分化的吸收細胞聚集在一個區(qū)域，形成“絨毛樣”結(jié)構(gòu)，保持了和在體的高度一致性。

其次，兩種培養(yǎng)在細胞干性維持和基因組穩(wěn)定性上存在巨大差異。在1965 年細胞學家海弗列克（Hayflick）發(fā)現(xiàn)正常人胚胎來源的成纖維細胞在衰老之前只能擴增40-60 代左右。目前，成體干細胞例如間充質(zhì)干細胞在體外2D 培養(yǎng)體系中只能在較短的時間和代數(shù)內(nèi)維持細胞干性。而長期維持的2D細胞株培養(yǎng)系統(tǒng)大都是永生化修飾的細胞或者是具有永生化能力的腫瘤細胞。另外，這些細胞在長期培養(yǎng)過程中均面臨著基因組不穩(wěn)定性的巨大挑戰(zhàn)。而類器官卻具有穩(wěn)定的表型和遺傳學特征，例如腸道來源類器官在體外持續(xù)傳代1 年以上都能維持自己的干性，并且發(fā)生極少的堿基突變[1,2]。所以，目前類器官是體外模擬上皮組織的最佳方式。

3 胚胎/誘導(dǎo)型干細胞來源的類器官研究可以和組織發(fā)育相關(guān)的教學相結(jié)合

傳統(tǒng)的器官發(fā)育相關(guān)教學主要依賴于不同時期胚胎組織的切片和大體標本及其影像資料[7]，旨在為學生描述器官發(fā)育的一個基本過程。以胃腸道發(fā)育為例：原腸胚受信號調(diào)控不斷完善內(nèi)胚層，使其進一步發(fā)育成包含前腸、中腸和后腸的原始腸管。前腸可以形成口腔、食管、胃、肝臟等，中腸可以形成小腸和升結(jié)腸等，后腸可以形成余下的結(jié)腸和直腸等部分。但是，憑借這些手段，不能動態(tài)的、精細的顯示器官的發(fā)育過程，更難理解干細胞是如何向一個特定的組織和器官發(fā)育調(diào)控的。目前，因為難以獲得人類胚胎材料，研究人員直接分析人類的器官發(fā)生和發(fā)育幾乎是不可能的，另外，受倫理問題的制約，人類胚胎體外培養(yǎng)也限定在14 天以內(nèi)[2,8]。

最新的進展顯示類器官生成卻可以忠實地再現(xiàn)體內(nèi)發(fā)生的許多發(fā)育步驟?？茖W家第一次實現(xiàn)由干細胞誘導(dǎo)分化成有功能的類器官是由辛辛那提兒童醫(yī)院的James M. Wells 實驗室完成[9]。他們對原始的多能性胚胎干細胞，通過使用activin A 激活干細胞內(nèi)TGF-β 信號通路, 促使其向內(nèi)胚層分化；接著在培養(yǎng)體系中添加FGF4 和Wnt3a, 使其特異性地向后腸分化, 形成后腸球狀細胞體；然后將這種細胞體轉(zhuǎn)移到Sato 等創(chuàng)立的成體腸干細胞培養(yǎng)體系，即包埋入基質(zhì)膠,同時添加腸道干細胞增殖必需的子R-spondin1 (Wnt 信號激活)、EGF、Noggin (BMP 通路抑制劑), Wnts 等生長因子，最終可以成功誘導(dǎo)形成包含各種腸上皮細胞和一些基質(zhì)成纖維細胞的成熟腸類器官[9]。

我們在本科生第二課堂和研究生科學進展研討時候介紹了相關(guān)工作。通過提問、回顧和討論等方式，我們引導(dǎo)學員進行下列問題的研討：科學家如何利用書本上經(jīng)典的發(fā)育學知識來指導(dǎo)最前沿的干細胞研究？干細胞來源的類器官培養(yǎng)又在哪些方面模擬和顯示了腸道的發(fā)生過程？這些過程與完整的胚胎發(fā)育有何相關(guān)性？全能干細胞的誘導(dǎo)分化和成體干細胞來源的類器官培養(yǎng)有什么異同？此外，根據(jù)類似的機理和策略，不同組織特異性類器官包括胃、腎、肺、肝等相繼被建立和報導(dǎo)[2,8]，為這個教學議題提供了豐富的素材。我們通過讓部分本科生和研究生進行延伸性文獻閱讀，對不同器官和系統(tǒng)間進行對比，分析其中的區(qū)別和聯(lián)系，使他們更好的了解了特定器官的發(fā)育過程，同時建立了用類器官去模擬在體的思維方式和相關(guān)的知識儲備。

4 類器官研究和干細胞相關(guān)疾病模型教學相結(jié)合

4.1 利用腸道干細胞幫助學生理解干細胞和組織更新的概念

醫(yī)學生通過細胞生物學和組織胚胎學的學習，對胚胎干細胞、誘導(dǎo)全能性干細胞和成體干細胞的概念有了初步的認識。因為成體的發(fā)育均來源于一個單細胞即受精卵，學生對胚胎干細胞的全能性比較容易理解。相比較而言，對單個成體干細胞的自我更新和多種分化潛能，學員還缺乏直觀的認識。相對于皮膚、神經(jīng)、血液等系統(tǒng)，單個腸道干細胞的培養(yǎng)和分析比較容易進行。本實驗室在前期工作基礎(chǔ)上[10]，已經(jīng)建立了相關(guān)的技術(shù)平臺，在教員前期準備和指導(dǎo)下，可以讓學生自己觀察單個的Lgr5腸干細胞在基質(zhì)凝膠內(nèi)的增殖和分化，即在一周的時間內(nèi)從一個細胞成長為一個球囊合并出芽的類器官結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)包含了多種細胞類型，并可以長期傳代。在教學活動中，我們會首先和學員討論類器官在形態(tài)上和組織切片中觀察到的腸道器官結(jié)構(gòu)上的異同，確認包含增殖細胞的隠窩區(qū)域和包含分化、死亡細胞的絨毛區(qū)域。然后讓同學講述他們是如何理解腸干細胞特性的，而單細胞水平相對于多細胞研究有什么樣的優(yōu)勢。這些和科研活動密切結(jié)合的、參與式的教學活動不但讓學員更加直觀的理解了成體干細胞的概念，也極大地提高了學生的興趣和積極性。學生們都驚訝于一個成體干細胞像胚胎干細胞一樣也有自己的“發(fā)育藍圖”，在沒有其他細胞的信息指引下，能自我復(fù)制和不斷分化，形成具有一定功能的包含多種細胞的類器官結(jié)構(gòu)。

4.2 通過類器官模型讓學員理解干細胞和微環(huán)境之間的關(guān)系

在介紹類器官的相關(guān)概念和系統(tǒng)時，我們還著重讓學員理解干細胞和微環(huán)境之間的關(guān)系。比如組織和胚胎學教學中會強調(diào)消化道粘膜的基本構(gòu)成即上皮、固有層和基層。結(jié)合腸道類器官模型，引導(dǎo)學生思考和討論的問題主要包括：固有層成分是否對干細胞起作用？基質(zhì)凝膠能夠代替固有層的什么功能，又不能代替什么功能？上皮細胞為什么不依賴固有層的細胞就能夠完成自我塑型？固有層里面的免疫細胞是否能支持和影響腸道干細胞？通過對這些問題的討論，加深了學員對原有組織學知識的理解。另外，學有余力的學生還通過查詢最新的文獻，了解了免疫細胞例如巨噬細胞和先天淋巴細胞對腸干細胞的調(diào)控作用，積極參加了學校組織的本科生文獻閱讀和講解大賽，得到了進一步的鍛煉，也讓他們能近距離的接觸科學發(fā)展的最前沿。

4.3 通過類器官模型讓學員理解組織的損傷修復(fù)過程

類器官的研究已經(jīng)廣泛用于包括遺傳性疾病、感染等多種疾病的模型[1-3,,8]。本教研室以放射復(fù)合傷和急性放射病研究為主，腸道類器官為我們研究急性放射病腸道損傷和篩選相關(guān)的抗放射病藥物提供了良好的實驗?zāi)Ｐ?。在傳統(tǒng)的教學手段中，我們只能依賴放射損傷前后不同時間實驗動物取材的腸道病理切片展示腸道組織的一些形態(tài)學變化，不能再現(xiàn)腸道隠窩細胞的損傷和再生的動態(tài)過程；另外學生對于較高劑量照射導(dǎo)致的隠窩克隆的消失缺乏直觀的感受。通過類器官培養(yǎng)平臺，我們制作了不同劑量X 射線照射的模型，學生通過倒置顯微鏡清晰的觀察到隠窩結(jié)構(gòu)在受到照射后的縮短、恢復(fù)和再延長的整個連續(xù)過程。針對射線造成的“克隆形成細胞”死亡，傳統(tǒng)的教學中依賴于一些永生化的細胞株或者腫瘤細胞株在2D水平的克隆形成實驗，即在輻射前后以不同密度在培養(yǎng)皿接種細胞，在一定時間后計數(shù)存活克隆的數(shù)目；這些實驗不僅耗費的時間長，也難以在形態(tài)學上模擬腸道隠窩的消失和存活。我們通過對培養(yǎng)24h-48h 后隱窩進行不同劑量的X 射線照射，繪制了良好的劑量存活曲線，并創(chuàng)建了相關(guān)的染色和成像方法，對存活和死亡腸類器官克隆進行直觀的區(qū)分和統(tǒng)計[11]。這些手段使學生在組織形態(tài)學層面更好的理解了腸上皮細胞損傷和再生，也在細胞生物學層面更清晰的認識到了“克隆形成細胞”的存活對組織再生的重要性。

5 小結(jié)和展望

為了實現(xiàn)拔尖創(chuàng)新醫(yī)學人才的培養(yǎng)，增強醫(yī)學生的科研意識和創(chuàng)新能力，需要在教學和培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化[4,6,12]。最新的生物醫(yī)學科研進展不斷被吸納到“形態(tài)學”相關(guān)的教材中，例如“細胞重編程”、“誘導(dǎo)型干細胞”的概念和內(nèi)容已經(jīng)加入人民衛(wèi)生出版社的第五版《醫(yī)學細胞生物學》和高等教育出版社的《組織學與胚胎學》第二版中?？梢灶A(yù)見，隨著干細胞技術(shù)、生物材料技術(shù)等技術(shù)的蓬勃發(fā)展，類器官在醫(yī)學和生命科學中的應(yīng)用必將大放異彩，這就對本科生和研究生的相關(guān)教材和教學內(nèi)容提出了新的需求。值得注意的是，相對于上世紀出現(xiàn)的2D 細胞培養(yǎng)技術(shù)，類器官技術(shù)讓我們第一次能將“模擬”的思維帶入形態(tài)學相關(guān)的教學中，促使學生從新的角度去理解在發(fā)育、疾病相關(guān)的組織形態(tài)改變中對干細胞的調(diào)控，思考干細胞相關(guān)的再生和修復(fù)等基本的生命科學問題，更好的訓(xùn)練學生建立“模型和模擬”的思維，增強科研意識，培養(yǎng)創(chuàng)新習慣，也形成了一個科研和教學相互融合和促進的生長點。