外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá)與MPA形成和冠心病的關(guān)系研究

黃青華 沃銘毅 陳敏強(qiáng) 袁武鋒 趙嫣 費(fèi)鮮明

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是冠心病等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。慢性炎癥反應(yīng)對(duì)AS的發(fā)展起著重要促進(jìn)作用，其中單核細(xì)胞與血小板聚集體（MPA）形成所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要的角色[2-3]。MPA可通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化而引起環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)增高[4]；筆者既往研究表明，木瓜蛋白酶可通過抑制中心因子AKT磷酸化而降低MPA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞COX-2表達(dá)，并抑制單核細(xì)胞粘附和分泌功能，提示單核細(xì)胞COX-2可能在AS及冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[5]。因此，單核細(xì)胞COX-2表達(dá)增高可能有助于預(yù)測(cè)AS及冠心病的發(fā)生，并可作為其風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。筆者通過觀察冠心病患者外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá)，探討其與MPA形成和冠心病發(fā)生之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2017年10月1日至12月31日在我院住院的冠心病患者66例，男41例，女25例，年齡34～78（46.0±25.0）歲；其中穩(wěn)定型心絞痛（SA）37 例，男24 例，女 13 例，年齡 34～72（47.6±18.3）歲；不穩(wěn)定型心絞痛（UA）29例，男 19例，女 10例，年齡 37～78（49.2±17.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）AS 性心臟病患者；（2）符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）首次入院確診者；（4）入院后治療前。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性心肌梗死；（2）急慢性感染或炎癥；（3）高血壓；（4）肝腎功能異常；（5）惡性腫瘤；（6）腦血管疾?。唬?）動(dòng)靜脈血栓史；（8）手術(shù)后；（9）孕婦；（10）2 周內(nèi)服用過任何藥物；（11）1個(gè)月內(nèi)使用過抗血栓藥物。收集同期在我院健康體檢者30例作為正常對(duì)照組，男20例，女 10 例，年齡 35～72（45±23）歲；均無常規(guī)血液學(xué)檢驗(yàn)、超聲、X線等檢查異常者。本研究均經(jīng)患者或其家屬以及體檢人員知情同意。各組間性別、年齡的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。

1.2 主要試劑與儀器、材料 CD41-FITC及CD14-PE單克隆抗體（法國Immunotech公司），COX-2單克隆抗體（美國Cell Signaling生物技術(shù)公司），細(xì)胞裂解液和TEN緩沖液（自配），MCP-1 ELISA試劑盒（美國Bioscience公司），淋巴細(xì)胞分離液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司），RPMI1640培養(yǎng)液（上海佳和生物科技有限公司）。FBS（美國Hyclone公司）。FC500-MCL流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter公司）、Mindray BC-6800血細(xì)胞分析儀和CRP-M100分析儀（中國邁瑞醫(yī)療公司），酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）、改良Neubauer計(jì)數(shù)板。

1.3 MPA水平和炎癥指標(biāo)測(cè)定 清晨空腹采集冠心病患者和志愿者靜脈血。采集枸櫞酸三鈉1∶9抗凝血2.7ml，加入CD14和CD41單克隆抗體，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)同時(shí)表達(dá)CD41和CD14的血小板比例，即MPA水平（%）；采集EDTA-K2抗凝血2ml，以血細(xì)胞分析儀測(cè)定WBC、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，并計(jì)算中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（NLR），以CRP-M100分析儀測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）濃度；采集無抗凝血 3ml，1 500g離心分離血清，采用單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA試劑盒測(cè)定MCP-1水平。操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 外周血單核細(xì)胞分離、處理和COX-2水平檢測(cè)按照筆者以往研究中的單核細(xì)胞分離、處理和Western blot檢測(cè)方法[5]。具體為：取健康人員和冠心病患者靜脈血3～5ml，肝素抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用含10%FBS的RPMl1640培養(yǎng)液懸浮，置6孔板中培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵箱貼壁2h后，用預(yù)溫培養(yǎng)基洗去未黏附細(xì)胞，懸浮細(xì)胞可重復(fù)黏附，得到更多貼壁，以培養(yǎng)基重新懸浮貼壁細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CD14的細(xì)胞比例，表達(dá)率＞90%為符合要求。然后以Neubauer計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/ml。以β-actin為內(nèi)參，前述單核細(xì)胞懸液以細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，充分混勻后取等量標(biāo)本上樣以SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜2h；脫脂奶粉封閉后COX-2單克隆抗體，孵育過夜；TBST漂洗膜；用HRP標(biāo)記的抗體孵育；ECL發(fā)光底物顯色后在Bio-Rad成像系統(tǒng)曝光。曝光結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行光密度檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，危險(xiǎn)因素分析采用logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組炎癥指標(biāo)、MPA和COX-2水平的比較 冠心病組 hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；UA組hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平以及MPA和COX-2水平均高于SA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見表1、圖1。

2.2 冠心病患者COX-2水平與MPA及各炎癥指標(biāo)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，COX-2表達(dá)水平與MPA、MCP-1、NLR 和 hs-CRP 均呈正相關(guān)（r=0.703、0.631、0.603、0.532，均P＜0.01）。COX-2 水平升高的冠心病患者M(jìn)PA水平顯著高于COX-2水平正常的患者，MPA水平升高冠心病患者COX-2水平顯著高于MPA水平正常的患者（P＜0.01）；見圖2。

表1 各組炎癥指標(biāo)的比較

圖1 SA和UA組患者M(jìn)PA和COX-2水平比較（與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與 SA 組比較，**P＜0.01）

2.3 冠心病患者logistic回歸分析結(jié)果 單因素回歸分析顯示COX-2、MPA、年齡、各炎癥指標(biāo)均為冠心病的危險(xiǎn)因素，多因素回歸分析顯示，除年齡、性別和WBC之外，其余各指標(biāo)均為冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，COX-2比其余指標(biāo)具有更高的OR值；見表2。

3 討論

圖2 冠心病危險(xiǎn)因素單核細(xì)胞COX-2水平與MPA水平的關(guān)系（與COX-2正常組、MPA正常組比較，**P＜0.01）

表2 冠心病危險(xiǎn)因素logistic回歸分析結(jié)果

AS是一種慢性炎癥性病變過程，血小板和WBC參與的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈硬化性血栓形成性疾病如冠心病的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[6]。眾多研究表明，炎癥在AS相關(guān)的心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7]；并且單核細(xì)胞誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)及巨噬細(xì)胞形成在AS的早起過程中起著重要的作用[8]。慢性炎癥多以WBC增高和各種炎癥介質(zhì)分泌為基本現(xiàn)象，從而可以各炎癥指標(biāo)的水平作為其評(píng)價(jià)基礎(chǔ)。單核細(xì)胞活化是一個(gè)復(fù)雜的過程，體現(xiàn)為趨化、黏附功能增強(qiáng)，并以炎癥因子如MCP-1分泌等為基本表征[9]。在本研究中，冠心病患者炎癥指標(biāo) MCP-1、hs-CRP、WBC和NLR水平明顯高于正常人群，顯示各炎癥指標(biāo)變化趨勢(shì)具有一致性，符合炎癥反應(yīng)的基本表現(xiàn)。以上結(jié)果一方面表明炎癥反應(yīng)與冠心病發(fā)生關(guān)系密切，同時(shí)也表明炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可使患者AS風(fēng)險(xiǎn)增加，從而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。另外，UA患者比SA患者具有更高水平炎癥指標(biāo)表達(dá)，表明多種因素所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與AS的進(jìn)展以及冠心病病情嚴(yán)重程度有關(guān)。因此，測(cè)定炎癥指標(biāo)水平可能有助于預(yù)測(cè)冠心病風(fēng)險(xiǎn)以及評(píng)估患者病情。

單核細(xì)胞與血小板黏附形成MPA并誘導(dǎo)兩者相互激活在AS發(fā)生中起著尤為重要的作用[8]。MPA及血小板源性細(xì)胞介質(zhì)協(xié)同誘導(dǎo)單核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化、促使其分泌和表達(dá)多種活性因子、顯著增強(qiáng)其趨化及黏附能力并介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附，從而放大或延長炎癥反應(yīng)，是AS發(fā)生、發(fā)展的上游病理生理基礎(chǔ)[10]。這充分表明MPA及其誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化在AS性疾病的發(fā)生、發(fā)展的早期過程中具有極為重要的作用。MPA形成可顯著增強(qiáng)單核細(xì)胞功能，有利于活化單核細(xì)胞侵入損傷內(nèi)皮細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL），從而形成泡沫細(xì)胞，這是AS發(fā)生的關(guān)鍵[11]。因此，MPA形成和炎癥反應(yīng)與心血管疾病關(guān)系密切。MPA形成過程中PS/PSGL-1連接可激活MAPK，通過MAPK ERK/p38而使單核細(xì)胞COX-2表達(dá)升高，調(diào)控單核細(xì)胞活化和黏附[4]。其中，COX-2可調(diào)節(jié)前列環(huán)素的產(chǎn)生從而對(duì)慢性炎癥的發(fā)生具有重要促進(jìn)作用[4]。在筆者的前期研究中顯示，木瓜蛋白酶抑制COX-2蛋白表達(dá)的同時(shí)，能降低單核細(xì)胞的黏附及其分泌炎癥蛋白MCP-1[5]，表明抑制COX-2可有效抑制炎癥反應(yīng)；因此，COX-2可能作為炎癥調(diào)控的靶點(diǎn)，其表達(dá)增加可能是MPA形成并激活單核細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致AS發(fā)生的關(guān)鍵物質(zhì)，而若能有效抑制其表達(dá)可能有助于AS相關(guān)疾病的防治。盡管筆者在本研究中只檢測(cè)和觀察了單核細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的改變，并未同時(shí)采用PCR法測(cè)定COX-2 mRNA表達(dá)，但研究結(jié)果顯示，SA和UA患者均表現(xiàn)為MPA形成和單核細(xì)胞COX-2表達(dá)增加，并且UA患者比SA患者M(jìn)PA和COX-2具有更高水平，表明COX-2表達(dá)增加與MPA形成增多具有一致性。而進(jìn)一步研究顯示，冠心病患者單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平與MPA比例呈正相關(guān)，并與炎癥指標(biāo)水平具有正相關(guān)，進(jìn)一步揭示和證實(shí)以COX-2表達(dá)為代表的炎癥標(biāo)志物水平增加與MPA形成誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化引起的炎癥反應(yīng)程度增高具有明顯相關(guān)性。結(jié)果同時(shí)也揭示了COX-2表達(dá)水平高低與冠心病進(jìn)展與否有密切的關(guān)系。因此，COX-2作為重要的炎癥調(diào)控分子，其在MPA誘導(dǎo)的單核細(xì)胞活化后的炎癥調(diào)控中扮演著重要角色，可能有助于冠心病的預(yù)測(cè)和病情評(píng)估。

炎癥標(biāo)志物水平在冠心病預(yù)測(cè)及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有重要價(jià)值[6]。報(bào)道顯示，hs-CRP、WBC和NLR對(duì)冠心病預(yù)測(cè)有較高價(jià)值，并與病情嚴(yán)重程度有關(guān)；并且hs-CRP和NLR可作為急性冠脈綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12-14]。因此，炎癥標(biāo)志物在冠心病診斷與預(yù)后中具有重要的意義。本研究在預(yù)測(cè)冠心病的各種炎癥指標(biāo)中，炎癥調(diào)控因子COX-2具有最高的OR值，單因素和多因素分析分別為7.812和6.332，表明患者單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平升高可顯著增加冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，并作為其獨(dú)立危險(xiǎn)因素有助于預(yù)測(cè)冠心病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)結(jié)果也進(jìn)一步提示并證實(shí)如有效抑制其表達(dá)可能有助于降低冠心病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究通過對(duì)冠心病患者外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估，初步提示COX-2表達(dá)增高與MPA形成增多具有聯(lián)動(dòng)關(guān)系，并可作為冠心病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。在此基礎(chǔ)上，如能進(jìn)一步結(jié)合COX-2 mRNA檢測(cè)進(jìn)行研究，將更有利于臨床實(shí)際應(yīng)用。