惡性黑色素瘤的黑色素含量與其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)性探討*

楊鈺瑩 劉莉 折虹 柯亨寧②

惡性黑色素瘤為最具侵襲性的癌癥之一，雖然占所有皮膚惡性腫瘤的比例不足5%，但死亡率極高［1-2］。所以惡性黑色素瘤的早期識別與診斷顯得尤為重要。黑色素是由黑色素細(xì)胞中的酪氨酸經(jīng)過一系列酶催化反應(yīng)合成。據(jù)文獻(xiàn)報道，皮膚及虹膜黑色素瘤組織中黑色素沉著的減少與較差的預(yù)后包括生存率下降有關(guān)［3-4］。但是尚無黑色素含量與腫瘤進(jìn)展和臨床分期的相關(guān)性的報道。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）是細(xì)胞從G1期至S期的調(diào)節(jié)蛋白［5］，在乳腺癌、皮膚惡性黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌和結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中檢測到cyclin D1異常增高［6］。本研究采用組織芯片的免疫組織化學(xué)（immunohistochem-istry，IHC）染色方法檢測黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達(dá)，并分析其與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，闡明其在惡性黑色素瘤中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

檢測購于西安艾麗娜生物有限公司189例惡性黑色素瘤患者組織中的黑色素含量和cyclin D1表達(dá)（126例原發(fā)病灶，63例轉(zhuǎn)移病灶）。包括男性92例和女性97例，年齡7～88歲（平均53.6歲，標(biāo)準(zhǔn)差13.5歲）。其中，126例原發(fā)性惡性黑色素瘤的病例包括91例（72.2%）皮膚惡性黑色素瘤和35例（27.8%）黏膜惡性黑色素瘤。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）黑色素瘤分期系統(tǒng)，12例（13.2%）、69例（75.8%）、8例（8.8%）和2例（2.2%）患者分別被診斷為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期皮膚惡性黑色素瘤。黏膜惡性黑色素瘤因現(xiàn)有臨床標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一而未分期。取材后將病理組織用4%多聚甲醛溶液固定并用石蠟包埋，然后將樣本制成組織芯片。由兩位病理專家通過H&E染色、HMB45和S100的IHC對病理組織做出最終特異性診斷。惡性黑色素瘤的組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司。該研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 IHC 本研究中采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）方法進(jìn)行IHC染色。標(biāo)本切片在60℃烤片1 h，脫蠟、水化、蒸餾水清洗和抗原修復(fù)。在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中洗滌后，室溫下用3%H2O2覆蓋組織10 min。PBS洗滌后用10%正常山羊血清ZLI-9022，購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，在37℃下封閉1 h。滴加一抗cyclin D1為1∶150；兔抗人單克隆抗體ab134175，購自美國Abcam公司，4℃孵育過夜。隔日，將切片用PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，37℃孵育20 min；PBS再次洗滌后孵育鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液KIT-9710，購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。采用3-氨基-9-乙基-1-咔唑（3-amino-9-ethyl-1-carboazole，AEC）顯色15 min，蘇木精復(fù)染，直接用水性封片劑封片。PBS代替一抗作為陰性對照。cyclin D1實驗片和陰性對照片顯微鏡下同時可以觀察黑色素的含量。

1.2.2 病理形態(tài)計量學(xué)分析 由兩名病理醫(yī)生采用雙盲法對切片進(jìn)行評估和IHC評分。參照Weichert等［7］研究方法，通過半定量評分系統(tǒng)評估cyclin D1的IHC染色，黑色素含量也參照下述評分方法評估。陽性腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度分為0分（無染色）、1分（淺紅色）、2分（紅色）和3分（深紅色）。陽性腫瘤細(xì)胞的比例分為0分（無染色）、1分（≤10%）、2分（11%～50%）、3分（51%～80%）和4分（＞80%）。腫瘤細(xì)胞的染色陽性強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例相乘后最終的IHC評分為0～12分。其中0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。使用Aperio Image Scope軟件和Olympus BX51顯微鏡，在400倍放大倍率下觀察每個樣品至少3個區(qū)域。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料組間差異的比較采用χ2檢驗或連續(xù)校正χ2檢驗，計量資料組間差異的比較采用U檢驗，相關(guān)關(guān)系使用Spearman相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑色素含量與黑色素瘤TNM分期關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，189例腫瘤樣本中，黑色素高含量者76例，無或低含量者113例。黑色素含量與腫瘤的侵襲深度和臨床分期有關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤組織來源和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P＞0.05）；T1、T2期黑色素瘤中的黑色素含量明顯高于T3、T4期（χ2=8.316，P=0.004，表1）。采用U檢驗分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ期黑色素瘤中的黑色素含量明顯高于Ⅲ、Ⅳ期黑色素瘤（P=0.038，圖1A）。將IHC評分作為計量資料，采用U檢驗得到同樣的結(jié)果（P=0.001，圖1B）。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及間質(zhì)區(qū)域均可見大量的黑色素沉著，呈棕褐色或黑色（圖2，3），部分遮蓋了組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。本研究結(jié)果提示，黑色素含量可能隨著腫瘤的侵襲和進(jìn)展而降低。

表1 黑色素含量和cyclin D1表達(dá)在惡性黑色素瘤中與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

表1 黑色素含量和cyclin D1表達(dá)在惡性黑色素瘤中與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（續(xù)表1）

2.2 cyclin D1表達(dá)

cyclin D1蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，著色細(xì)胞呈紅色（圖2，3），在部分腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也可見陽性染色。189例腫瘤樣本中，14例（9例原發(fā)病灶、5例轉(zhuǎn)移病灶）因黑色素遮蓋腫瘤細(xì)胞無法做出IHC陽性判讀，其余175例cyclin D1高表達(dá)者80例，低表達(dá)者95例。cyclin D1表達(dá)與年齡、性別、侵襲深度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織來源無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.3 惡性黑色素瘤組織中的cyclin D1表達(dá)與黑色素含量的相關(guān)性分析

在175例腫瘤標(biāo)本中，采用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)黑色素的表達(dá)和cyclin D1陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.144，P=0.057，圖4A）。然而，黑色素的含量和cyclin D1表達(dá)在58例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤中呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.271，P=0.039，圖4B）。結(jié)果提示，黑色素在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中降低可能與腫瘤細(xì)胞的增殖加快和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

圖1 黑色素在皮膚黑色素瘤中的含量

圖2 原發(fā)性惡性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達(dá)（IHC×400）

圖3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤中的黑色素含量和cyclin D1表達(dá)（IHC×400）

圖4 惡性黑色素瘤組織中cyclin D1表達(dá)與黑色素含量的相關(guān)性分析

3 討論

黑色素瘤細(xì)胞為來源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞。合成黑色素為正常黑色素細(xì)胞的功能，黑色素的產(chǎn)生在名為黑素體的特定卵圓形細(xì)胞器中。在黑素體內(nèi)合成的黑色素通過樹突轉(zhuǎn)運到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞，并在角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的核周區(qū)域積累，被認(rèn)為可以保護(hù)DNA免受紫外線的損傷［8］。黑色素細(xì)胞惡變后產(chǎn)生黑色素的功能、黑色素的代謝以及其病理意義研究較為有限。

本研究結(jié)果顯示，189例惡性黑色素瘤患者組織中的黑色素高含量者為76例（40.2%）。黑色素含量與患者的年齡、性別、腫瘤組織來源和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與腫瘤的侵襲深度（P=0.001）和臨床分期（P=0.038）有關(guān)，提示黑色素含量可能隨著腫瘤的侵襲和進(jìn)展而下調(diào)。目前，國內(nèi)外關(guān)于黑色素含量與惡性黑色素瘤的分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究報道較少。Moreau等［3］分析了2000年至2009年美國18個州的侵襲性黑色素瘤病例，研究發(fā)現(xiàn)無色素性黑色素瘤的5年生存率（overall survival，OS）明顯低于有色素性黑色素瘤。Brouwer等［4］在444例結(jié)膜黑色素瘤中使用單變量和多變量回歸分析研究了虹膜顏色、膚色和腫瘤色素沉著與臨床參數(shù)和結(jié)果之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤低色素沉著與轉(zhuǎn)移形成有關(guān)，且這類患者預(yù)后較差。Brozyna等［9］分析了黑色素瘤患者的OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）與腫瘤色素沉著程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者中，無黑色素沉著患者的DFS和OS短于黑色素沉著患者。上述研究缺乏黑色素含量的半定量和進(jìn)一步研究。本研究與上述研究的差異為：1）本研究在病理切片中將黑色素含量根據(jù)鏡下觀察進(jìn)行半定量，而上述研究無；2）本研究首次將黑色素含量與臨床分期進(jìn)行相關(guān)性分析，而非分析具體指標(biāo)相關(guān)性；3）本研究還發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黑色素瘤中黑色素含量與cyclin D1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究的局限性在于因為缺失隨訪數(shù)據(jù)而未作生存率分析，但是現(xiàn)有研究結(jié)果表明無或低色素沉著的腫瘤多為惡性程度較高的Ⅲ、Ⅳ期，該結(jié)果間接提示無或低黑色素含量的患者預(yù)后可能不良。

cyclin D1作為細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控［10］。Oba等［11］采用IHC法檢測78例原發(fā)性黑素瘤、24例轉(zhuǎn)移性病灶和42例良性痣中cyclin D1的表達(dá)，結(jié)果顯示原發(fā)性黑素瘤中cyclin D1的表達(dá)明顯高于良性痣，cyclin D1陽性率在原發(fā)性黑色素瘤中的比例高于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。但是這與另外兩項研究結(jié)果不一致，Georgieva等［12］研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1表達(dá)與組織病理學(xué)分期無關(guān)。Oba等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Breslow深度和cyclin D1表達(dá)水平無關(guān)系，所有原發(fā)性黑素瘤的cyclin D1表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移的存在并無關(guān)。cyclin D1表達(dá)并不能預(yù)測淺表和原發(fā)性結(jié)節(jié)性黑素瘤的DFS或OS［11-13］。上述研究結(jié)果表明，cyclin D1在原發(fā)性黑素瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)展過程中作用存在爭議。本研究結(jié)果顯示，cyclin D1的表達(dá)與年齡、性別、侵襲深度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織來源無關(guān)，與上述部分研究結(jié)論相一致。黑色素的含量與cyclin D1的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤中呈負(fù)相關(guān)，提示黑色素的降低可能參與轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的增殖。

在臨床病理診斷中，IHC染色為不可或缺的環(huán)節(jié)。在過氧化物酶法染色過程的最后一步通常會使用IHC染色劑3，3-二氨基苯聯(lián)胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，其終產(chǎn)物呈棕色。然而，黑色素的顏色也是棕色或黑色，且黑色素屬于組織內(nèi)源性色素，標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟和包埋等一系列處理后，黑色素依然存于組織中。針對黑色素干擾病理診斷的問題，研究者會使用強(qiáng)氧化劑將黑色素脫色后再進(jìn)行后續(xù)的IHC染色和診斷［14］。通過脫色素方法雖然能夠?qū)⒏采w于組織的大部分色素脫去，但是同時黑色素的重要價值也被忽略。本研究中使用的IHC顯色劑AEC終產(chǎn)物顏色為紅色［15］，在顯微鏡下可以明顯的與黑色素區(qū)分，故在同一張切片上可以同時對黑色素和cyclin D1進(jìn)行判讀。由于既往對于黑色素的診斷意義缺少認(rèn)識，病理組織中黑色素含量易被忽略。本研究結(jié)果顯示，采用組織切片預(yù)估黑色素含量是必要且可行的，對于黑色素瘤的預(yù)后判斷是有意義的。未來亟需黑色素含量與黑色素瘤患者OS的關(guān)系以及黑色素沉著機(jī)制與腫瘤生長和侵襲的進(jìn)一步研究。此外，如果患者的病理組織表現(xiàn)出低黑色素含量和cyclin D1高表達(dá)，結(jié)合其他臨床檢驗結(jié)果預(yù)估腫瘤惡性程度較高，預(yù)后不良，手術(shù)應(yīng)盡早切除并進(jìn)行可疑淋巴結(jié)清掃。

綜上所述，黑色素含量與惡性黑色素瘤的侵襲和進(jìn)展相關(guān)，cyclin D1在惡性黑色素瘤中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間無顯著性差異，但是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中，cyclin D1的表達(dá)與黑色素含量呈負(fù)相關(guān)，其結(jié)合在指導(dǎo)惡性黑色素瘤的病理診斷和預(yù)后分析方面可能具有重要意義。